यहां, हम विट्रो और विवो में नाक स्व-इकट्ठे नैनोइमल्शन ट्यूमर वैक्सीन की तैयारी और मूल्यांकन के लिए विस्तृत तरीके प्रस्तुत करते हैं।
एपिटोप पेप्टाइड्स ने अपनी सुरक्षा, उच्च विशिष्टता और सुविधाजनक उत्पादन के कारण ट्यूमर टीकों के क्षेत्र में व्यापक ध्यान आकर्षित किया है; विशेष रूप से, कुछ एमएचसी आई-प्रतिबंधित एपिटोप ट्यूमर कोशिकाओं को साफ करने के लिए प्रभावी साइटोटॉक्सिक टी लिम्फोसाइट गतिविधि को प्रेरित कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, नाक प्रशासन अपनी सुविधा और बेहतर रोगी अनुपालन के कारण ट्यूमर टीकों के लिए एक प्रभावी और सुरक्षित वितरण तकनीक है। हालांकि, एपिटोप पेप्टाइड्स उनकी खराब इम्युनोजेनेसिटी और प्रसव दक्षता की कमी के कारण नाक वितरण के लिए अनुपयुक्त हैं। नैनोइमल्शन (एनई) थर्मोडायनामिक रूप से स्थिर प्रणालियां हैं जिन्हें एंटीजन के साथ लोड किया जा सकता है और सीधे नाक की श्लैष्मिक सतह पर पहुंचाया जा सकता है। Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) लैमिनिन का कोर पेंटापेप्टाइड है, जो मानव श्वसन उपकला कोशिकाओं द्वारा व्यक्त एक इंटीग्रिन-बाइंडिंग पेप्टाइड है। इस अध्ययन में, सिंथेटिक पेप्टाइड आईकेवीएवी-ओवीए257-264 (आई-ओवीए) युक्त एक इंट्रानेसल स्व-इकट्ठे एपिटोप पेप्टाइड एनई ट्यूमर वैक्सीन को कम ऊर्जा पायसीकरण विधि द्वारा तैयार किया गया था। आईकेवीएवी और ओवीए257-264 का संयोजन नाक म्यूकोसल उपकला कोशिकाओं द्वारा एंटीजन अपटेक को बढ़ा सकता है। यहां, हम ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम), परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम), और गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस) द्वारा भौतिक रासायनिक विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित करते हैं; म्यूसिन प्रोटीन की उपस्थिति में स्थिरता; बीईएएस -2 बी कोशिकाओं और सी 57बीएल / 6 चूहों के नाक और फेफड़ों के ऊतकों की कोशिका व्यवहार्यता की जांच करके विषाक्तता; कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) द्वारा सेलुलर अपटेक; विवो में छोटे जानवरों की इमेजिंग द्वारा प्रोफाइल जारी करें; और ई.जी.7 ट्यूमर-असर मॉडल का उपयोग करके वैक्सीन का सुरक्षात्मक और चिकित्सीय प्रभाव। हम उम्मीद करते हैं कि प्रोटोकॉल नोवेल टी सेल एपिटोप पेप्टाइड म्यूकोसल टीकों के भविष्य के विकास के लिए तकनीकी और सैद्धांतिक सुराग प्रदान करेगा।
सबसे महत्वपूर्ण सार्वजनिक स्वास्थ्य नवाचारों में से एक के रूप में, टीकेमानव रोग के वैश्विक बोझ से लड़ने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। उदाहरण के लिए, वर्तमान में, कोविड-19 रोगों के लिए 120 से अधिक उम्मीदवार टीकों का परीक्षण किया जा रहा है, जिनमें से कुछ कोकई देशों में अनुमोदित किया गया है। हाल की रिपोर्टों में कहा गया है कि कैंसर के टीकों ने नैदानिक कैंसर उपचार की प्रगति में प्रभावी ढंग से सुधार किया है क्योंकि वे कैंसर रोगियों की प्रतिरक्षा प्रणालीको शरीर के लिए विदेशी के रूप में एंटीजन को पहचानने के लिए निर्देशित करते हैं। इसके अलावा, ट्यूमर कोशिकाओं के अंदर या बाहर स्थित कई टी सेल एपिटोप्स का उपयोग पेप्टाइड टीकों को डिजाइन करने के लिए किया जा सकता है, जिन्होंने रेडियोथेरेपी और कीमोथेरेपी 4,5 से जुड़े महत्वपूर्ण विषाक्तता की कमी के कारण मेटास्टैटिक कैंसर के उपचार में फायदे दिखाए हैं। 1990 के दशक के मध्य से, ट्यूमर उपचार के लिए प्रीक्लिनिकल और नैदानिक परीक्षण मुख्य रूप से एंटीजन पेप्टाइड टीकों का उपयोग करके आयोजित किए गए हैं, लेकिन कुछ टीकेकैंसर रोगियों पर पर्याप्त चिकित्सीय प्रभाव प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, पेप्टाइड एपिटोप्स के साथ कैंसर के टीकों में खराब इम्युनोजेनेसिटी और अपर्याप्त वितरण दक्षता होती है, जो बाह्य पेप्टाइड्स के तेजी से क्षरण के कारण हो सकती है जो प्रशासन की साइट से तेजी से फैलती है, जिससेप्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा अपर्याप्त एंटीजन अपटेक होता है। इसलिए वैक्सीन डिलीवरी तकनीक से इन बाधाओं को दूर करना जरूरी है।
ओवीए 257-264, एमएचसी वर्ग I-बाइंडिंग257-264 एपिटोप को संलयन प्रोटीन के रूप में व्यक्त किया जाता है, एक अक्सर इस्तेमाल किया जाने वाला मॉडल एपिटोप8 है। इसके अलावा, ओवीए257-264 ट्यूमर के खिलाफ अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है, जो साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइट (सीटीएल) प्रतिक्रिया पर निर्भर करता है। यह ट्यूमर में एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं द्वारा मध्यस्थ है, जो ओवीए257-264 पेप्टाइड द्वारा प्रेरित होते हैं। यह अपर्याप्त ग्रैनजाइम बी की विशेषता है, जो साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं द्वारा जारी किया जाता है, जिससे लक्ष्य कोशिकाओं8 के एपोप्टोसिस होते हैं। हालांकि, मुक्त ओवीए257-264 पेप्टाइड प्रशासन कम सीटीएल गतिविधि को प्रेरित कर सकता है क्योंकि इन एंटीजन का उत्थान एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाओं (एपीसी) के बजाय निरर्थक कोशिकाओं में होता है। उचित प्रतिरक्षा उत्तेजना की कमी के परिणामस्वरूप सीटीएल गतिविधि5 होती है। इसलिए, प्रभावोत्पादक सीटीएल गतिविधि का प्रेरण काफी प्रगति की मांग करता है।
उपकला कोशिकाओं द्वारा प्रदान की गई बाधा और बलगम के निरंतर स्राव के कारण, वैक्सीन एंटीजन नाक श्लेष्म 9,10 से तेजी से हटा दिए जाते हैं। एक कुशल वैक्सीन वेक्टर विकसित करना जो म्यूकोसल ऊतक से गुजर सकता है, महत्वपूर्ण है क्योंकि एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाएं म्यूकोसल एपिथेलियम9 के नीचे स्थित हैं। टीकों का इंट्रानेजल इंजेक्शन सैद्धांतिक रूप से म्यूकोसलसंक्रमण से लड़ने के लिए म्यूकोसल प्रतिरक्षा को प्रेरित करता है। इसके अलावा, नाक वितरण इसकी सुविधा, आंतों के प्रशासन से बचने और बेहतर रोगी अनुपालन के कारण टीकों के लिए एक प्रभावी और सुरक्षित प्रशासन विधिहै। इसलिए, नोवेल पेप्टाइड एपिटोप नैनोवैक्सीन के लिए नाक वितरण प्रशासन का एक अच्छा साधन है।
सेल-ऊतक और सेल-सेल इंटरैक्शन के एपिटोप्स को संयोजित करने के लिए कई सिंथेटिक बायोमैटेरियल्स तैयार किए गए हैं। कुछ बायोएक्टिव प्रोटीन, जैसे कि इले-लिस-वैल-अला-वैल (आईकेवीएवी), को बायोएक्टिविटीप्रदान करने के लिए हाइड्रोगेल की संरचना के हिस्से के रूप में पेश किया गया है। यह पेप्टाइड संभवतः सेल अटैचमेंट, माइग्रेशन और आउटग्रोथ13 में योगदान देता है और विभिन्न कैंसर सेल प्रकारों के साथ बातचीत करने के लिए इंटीग्रिन α 3 : 1 और α6 : 1 को बांधता है। आईकेवीएवी एक सेल आसंजन पेप्टाइड है जो लैमिनिन बेसमेंट झिल्ली प्रोटीन α1 श्रृंखला से प्राप्त होता है जिसका उपयोग मूल रूप से तंत्रिका माइक्रोएन्वायरमेंट को मॉडल करने और न्यूरोनल भेदभाव14 का कारण बनने के लिए किया जाता था। इसलिए, इस नोवेल वैक्सीन के लिए एक कुशल वितरण वाहन खोजना रोग नियंत्रण के लिए महत्वपूर्ण है।
हाल ही में रिपोर्ट किए गए इमल्शन सिस्टम, जैसे कि W805EC और MF59, को निष्क्रिय इन्फ्लूएंजा वैक्सीन या पुनः संयोजक हेपेटाइटिस बी सतह एंटीजन के नाक गुहा वितरण के लिए भी जोड़ा गया है और म्यूकोसल और प्रणालीगत प्रतिरक्षादोनों को ट्रिगर करने के लिए चित्रित किया गया है। नैनोइमल्शन (एनई) में पार्टिकुलेट म्यूकोसलडिलीवरी सिस्टम की तुलना में प्रभावी सहायक दवाओं के साथ आसान प्रशासन और सुविधाजनक सह-गठन के फायदे हैं। नैनोइमल्शन टीकों को पारंपरिक डिसेन्सिटाइजेशन से अलग निरंतर तरीके से एलर्जी फेनोटाइप को बदलने की सूचना दी गई है, जिसके परिणामस्वरूप दीर्घकालिक दमनकारी प्रभावहोते हैं। दूसरों ने बताया कि एमटीबी-विशिष्ट इम्यूनोडोमिनेंट एंटीजन के साथ संयुक्त नैनोइमल्शन शक्तिशाली म्यूकोसल सेल प्रतिक्रियाओं को प्रेरित कर सकते हैं औरमहत्वपूर्ण सुरक्षा प्रदान कर सकते हैं। इसलिए, सिंथेटिक पेप्टाइड आईकेवीएवी-ओवीए 257-264 (आई-ओवीए, ओवीए257-264 से बंधे आईकेवीएवी से युक्त पेप्टाइड) के साथ एक नया इंट्रानेजलस्व-इकट्ठे नैनोवैक्सीन डिजाइन किया गया था। इस नोवेल नैनोवैक्सीन का व्यवस्थित रूप से आकलन करना महत्वपूर्ण है।
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य नैनोवैक्सीन की भौतिक रासायनिक विशेषताओं, विषाक्तता और स्थिरता का व्यवस्थित रूप से मूल्यांकन करना है, यह पता लगाना है कि क्या एंटीजन अपटेक और सुरक्षात्मक और चिकित्सीय प्रभाव तकनीकी साधनों का उपयोग करके बढ़ाया जाता है, और मुख्य प्रयोगात्मक सामग्री पर विस्तृत है। इस अध्ययन में, हमने भौतिक रासायनिक विशेषताओं और स्थिरता का अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला स्थापित की, सीसीके -8 द्वारा आई-ओवीए एनई से बीईएएस -2 बी कोशिकाओं की विषाक्तता के परिमाण का निर्धारण किया, और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके वैक्सीन के लिए बीईएएस -2 बी कोशिकाओं की एंटीजन-प्रस्तुत करने की क्षमता का निरीक्षण किया, विवो और इन विट्रो में इस नए नैनोवैक्सीन के रिलीज प्रोफाइल का मूल्यांकन किया।और ई.जी7-ओवीए ट्यूमर-असर माउस मॉडल का उपयोग करके इस वैक्सीन के सुरक्षात्मक और चिकित्सीय प्रभाव का पता लगाएं।
इम्यूनोसाइट झिल्ली के साथ कार्यात्मक नैनोवैक्सीन के रोग-लक्षित चिकित्सा में बहुत फायदे हैं, और साइड इफेक्ट्स को अद्वितीय ट्यूमर ट्रोपिज्म, विशिष्ट लक्ष्यों की पहचान, लंबे समय तक परिसंचरण, बढ़ी हुई इ?…
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन कार्यक्रम के नंबर 31670938, 32070924, 32000651, नंबर 2014 jcyja0107 और नंबर 2019jcyja-msxmx0159 द्वारा समर्थित किया गया 202090031035 202090031021 था।
96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | Bio-Rad 6.0 | |
CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
fetal bovine serum (FBS) | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30088.03 | |
FITC-labeled I-OVA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | NA | |
HPLC | Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd. | E2695 | |
Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
IPC-208 | Chong Qing University, China | NA | |
IVIS system | Caliper Life Science Limited Company | NA | |
JEM-1230 TEM | JEOL Limited Company of Japan | 1230 TEM | |
Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | NA | |
MPLA | Invivogen Lit. Co. |
tlrl-mpla | |
Neomycin Sulfate Ointment | Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd. | H31022262 | |
OVA257–264 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30809.01 | |
Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope | Zeiss, Germany | Zeiss LSM800 |