Forberedelse, egenskaber, toksicitet og effektivitetsevaluering af den nasale selvmonterede nanoemulsionstumorvaccine in vitro og in vivo

Summary

Her præsenterer vi detaljerede metoder til fremstilling og evaluering af den nasale selvmonterede nanoemulsionstumorvaccine in vitro og in vivo.

Abstract

Epitoppeptider har tiltrukket sig udbredt opmærksomhed inden for tumorvacciner på grund af deres sikkerhed, høje specificitet og bekvemme produktion; især kan nogle MHC I-begrænsede epitoper inducere effektiv cytotoksisk T-lymfocytaktivitet for at rydde tumorceller. Derudover er nasal administration en effektiv og sikker leveringsteknik til tumorvacciner på grund af dens bekvemmelighed og forbedrede patientoverholdelse. Imidlertid er epitoppeptider uegnede til nasal levering på grund af deres dårlige immunogenicitet og manglende leveringseffektivitet. Nanoemulsioner (NE’er) er termodynamisk stabile systemer, der kan fyldes med antigener og leveres direkte til næseslimhindens overflade. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) er kernen pentapeptid af laminin, et integrinbindende peptid udtrykt af humane respiratoriske epitelceller. I denne undersøgelse blev en intranasal selvmonteret epitoppeptid NE tumorvaccine indeholdende det syntetiske peptid IKVAV-OVA_{257-264 (I-OVA} ) fremstillet ved en lavenergiemulgeringsmetode. Kombinationen af IKVAV og OVA_257-264 kan øge antigenoptagelsen i næseslimhindeepitelceller. Her etablerer vi en protokol til undersøgelse af de fysisk-kemiske egenskaber ved transmissionselektronmikroskopi (TEM), atomkraftmikroskopi (AFM) og dynamisk lysspredning (DLS); stabilitet i nærvær af mucinprotein; toksicitet ved undersøgelse af cellelevedygtigheden af BEAS-2B-celler og næse- og lungevæv hos C57BL/6-mus cellulær optagelse ved konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM); frigivelsesprofiler ved at afbilde små dyr in vivo og vaccinens beskyttende og terapeutiske virkning ved hjælp af en E.G7 tumorbærende model. Vi forventer, at protokollen vil give tekniske og teoretiske fingerpeg om den fremtidige udvikling af nye T-celleepitoppeptidslimhindevacciner.

Introduction

Som en af de mest kritiske innovationer inden for folkesundhed spiller vacciner en central rolle i bekæmpelsen af den globale byrde af sygdomme^{hos mennesker 1}. F.eks. testes der i øjeblikket mere end 120 kandidatvacciner mod covid-19-sygdomme, hvoraf nogle er blevet godkendt i mange lande². Nylige rapporter siger, at kræftvacciner effektivt har forbedret fremskridtene med kliniske kræftbehandlinger, fordi de leder kræftpatienters immunsystem til at genkende antigener som fremmede for kroppen³. Desuden kan flere T-celleepitoper placeret inden for eller uden for tumorceller bruges til at designe peptidvacciner, som har vist fordele ved behandling af metastatiske kræftformer på grund af manglen på den signifikante toksicitet forbundet med strålebehandling og kemoterapi ^4,5. Siden midten af 1990’erne er prækliniske og kliniske forsøg med tumorbehandling hovedsageligt blevet udført ved hjælp af antigenpeptidvacciner, men få vacciner udviser en tilstrækkelig terapeutisk effekt på kræftpatienter⁶. Desuden har kræftvacciner med peptidepitoper dårlig immunogenicitet og utilstrækkelig leveringseffektivitet, hvilket kan skyldes den hurtige nedbrydning af ekstracellulære peptider, der diffunderer hurtigt fra administrationsstedet, hvilket fører til utilstrækkelig antigenoptagelse af immunceller⁷. Derfor er det nødvendigt at overvinde disse hindringer med vaccineleveringsteknologi.

OVA 257-264, MHC klasse I-bindende_257-264 epitop udtrykt som et fusionsprotein, er en hyppigt anvendt model epitop⁸. Derudover er OVA_257-264 afgørende for det adaptive immunrespons mod tumorer, som afhænger af det cytotoksiske T-lymfocytrespons (CTL). Det medieres af antigenspecifikke CD8 ⁺ T-celler i tumoren, som induceres af OVA_{257-264-peptidet} . Det er kendetegnet ved utilstrækkelig granzym B, som frigives af cytotoksiske T-celler, hvilket fører til apoptose af målceller⁸. Imidlertid kan fri OVA_257-264 peptidadministration inducere lidt CTL-aktivitet, fordi optagelsen af disse antigener forekommer i uspecifikke celler snarere end antigenpræsenterende celler (APC’er). Manglen på passende immunstimulering resulterer i CTL-aktivitet⁵. Derfor kræver induktion af effektiv CTL-aktivitet betydelige fremskridt.

På grund af barrieren fra epitelceller og den kontinuerlige udskillelse af slim fjernes vaccineantigener hurtigt fra næseslimhinden ^9,10. Udvikling af en effektiv vaccinevektor, der kan passere gennem slimhindevævet, er afgørende, fordi de antigenpræsenterende celler er placeret under slimhindepitelet⁹. Intranasal injektion af vacciner inducerer teoretisk slimhindeimmunitet for at bekæmpe slimhindeinfektion¹¹. Derudover er nasal levering en effektiv og sikker administrationsmetode til vacciner på grund af dens bekvemmelighed, undgåelse af tarmadministration og forbedret patientoverensstemmelse⁷. Derfor er nasal levering et godt administrationsmiddel til den nye peptidepitop nanovaccine.

Flere syntetiske biomaterialer er blevet udtænkt til at kombinere epitoper af celle-væv og celle-celle interaktioner. Visse bioaktive proteiner, såsom Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), er blevet introduceret som en del af hydrogelens struktur for at give bioaktivitet¹². Dette peptid bidrager sandsynligvis til cellebinding, migration og udvækst¹³ og binder integriner α 3β1 og_{α 6β1} til at interagere med forskellige kræftcelletyper. IKVAV er et celleadhæsionspeptid afledt af lamininkældermembranproteinet α_1-kæden, der oprindeligt blev brugt til at modellere det neurale mikromiljø og forårsage neuronal differentiering¹⁴. Derfor er det vigtigt at finde et effektivt leveringsmiddel til denne nye vaccine for sygdomsbekæmpelse.

Nyligt rapporterede emulsionssystemer, såsom W805EC og MF59, er også blevet sammensat til levering af næsehulen af inaktiveret influenzavaccine eller rekombinant hepatitis B-overfladeantigen og illustreret til at udløse både slimhinde og systemisk immunitet¹⁵. Nanoemulsioner (NE’er) har fordelene ved nem administration og bekvem co-formation med effektive adjuvanser sammenlignet med partikelslimhindeafgivelsessystemer¹⁶. Nanoemulsionsvacciner er blevet rapporteret at ændre den allergiske fænotype på en vedvarende måde, der adskiller sig fra traditionel desensibilisering, hvilket resulterer i langsigtede undertrykkende virkninger¹⁷. Andre rapporterede, at nanoemulsioner kombineret med Mtb-specifikke immunodominant antigener kunne inducere potente slimhindecelleresponser og give betydelig beskyttelse¹⁸. Derfor blev en ny intranasal selvsamlet nanovaccine med det syntetiske peptid IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, peptidet bestående af IKVAV bundet til OVA_257-264) designet. Det er vigtigt at vurdere denne nye nanovaccine systematisk.

Formålet med denne protokol er systematisk at evaluere nanovaccinens fysisk-kemiske egenskaber, toksicitet og stabilitet, påvise, om antigenoptagelse og beskyttende og terapeutiske virkninger forbedres ved hjælp af tekniske midler, og uddybe det vigtigste eksperimentelle indhold. I denne undersøgelse etablerede vi en række protokoller til at studere de fysisk-kemiske egenskaber og stabilitet, bestemme størrelsen af toksiciteten af I-OVA NE til BEAS-2B-celler af CCK-8 og observere BEAS-2B-cellernes antigenpræsenterende evne til vaccinen ved hjælp af konfokal mikroskopi, evaluere frigivelsesprofilerne for denne nye nanovaccine in vivo og in vitroog detektere den beskyttende og terapeutiske virkning af denne vaccine ved hjælp af en E.G7-OVA tumorbærende musemodel.

Protocol

Dyreforsøgene blev udført i overensstemmelse med Laboratory Animal-Guideline for ethical review of animal welfare (GB/T 35892-2018) og blev godkendt af Laboratory Animal Welfare and Ethics Committee ved Third Military Medical University. Musene blev aflivet ved en intraperitoneal injektion af 100 mg/kg 1% natriumpentobarbital. 1. Forberedelse af I-OVA NE Bland 1 mg monophosphoryllipid A (MPLA) med 100 μL DMSO, hvirvel i 5 minutter, og lad det stå i 4 timer ved s…

Representative Results

I henhold til protokollen afsluttede vi forberedelsen og in vitro og in vivo eksperimentel evaluering af nasal tumor nanovaccine levering. TEM, AFM og DLS er effektive midler til vurdering af de grundlæggende egenskaber ved overfladezetapotentialet og nanovaccinens partikelstørrelse (figur 1). BEAS-2B epitelceller er en nyttig screeningsmodel til in vitro toksicitetstest af nasale vacciner (figur 2A). Mikrofotografierne farvet med H&…

Discussion

Nanovacciner funktionaliseret med immunocytmembraner har store fordele ved sygdomsmålrettet terapi, og bivirkningerne minimeres af egenskaber som unik tumortropisme, identifikation af specifikke mål, langvarig cirkulation, forbedrede intercellulære interaktioner og lav systemisk toksicitet. De kan også let integreres med andre behandlingsmoduler til behandling af kræft i samarbejde^16,20. Ønskelige egenskaber kan opnås ved at kontrollerefysiske og kemiske e…

Materials

96-well plates	Corning Incorporated, USA	CLS3922
Bio-Rad 6.0 microplate reader	Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA	Bio-Rad 6.0
CCK-8 kits	Dojindo, Japan	CK04
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D9542
fetal bovine serum (FBS)	Hyclone (Life Technology, USA)	SH30088.03
FITC-labeled I-OVA	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
HF 90/240 Incubator	Heal Force, Switzerland	NA
HPLC	Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd.	E2695
Inverted Microscope	Nikon,Japan	DSZ5000X
IPC-208	Chong Qing University, China	NA
IVIS system	Caliper Life Science Limited Company	NA
JEM-1230 TEM	JEOL Limited Company of Japan	1230 TEM
Malvern NANO ZS	Malvern Instruments Ltd., UK	NA
MPLA	Invivogen Lit. Co.	tlrl-mpla
Neomycin Sulfate Ointment	Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd.	H31022262
OVA257–264	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
RPMI 1640 medium	Hyclone (Life Technology, USA)	SH30809.01
Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope	Zeiss, Germany	Zeiss LSM800