Эффективное редактирование генома мышей с помощью ЭЛЕКТРОПОРАЦИИ ЗИГОТ CRISPR
Summary
Здесь мы описываем простую технику, предназначенную для эффективной генерации генетически модифицированных мышей, под названием CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Этот метод обеспечивает редактирование реагентов путем электропорации в эмбрионы с эффективностью, приближающейся к 100%. Этот протокол эффективен для точечных мутаций, небольших геномных вставок и делеций у эмбрионов млекопитающих.
Abstract
Благодаря исключительной эффективности, точности и простоте система CRISPR/Cas9 значительно улучшила редактирование генома в клеточных культурах и лабораторных экспериментах на животных. При создании животных моделей электропорация зигот обеспечивает более высокую эффективность, простоту, стоимость и пропускную способность в качестве альтернативы методу микроинъекции золотого стандарта. Электропорация также более мягкая, с более высокой жизнеспособностью и надежно доставляет рибонуклеопротеины Cas9 / однонаправленной РНК (sgRNA) (RNP) в зиготы распространенных лабораторных штаммов мышей (например, C57BL / 6J и C57BL / 6N), что приближается к 100% эффективности доставки. Этот метод позволяет вставлять / делеционировать (indels) мутации, точечные мутации, делецию целых генов или экзонов и небольшие вставки в диапазоне 100-200 bp для вставки LoxP или коротких тегов, таких как FLAG, HA или V5. Несмотря на постоянное улучшение, здесь мы представляем текущее состояние CRISPR-EZ в протоколе, который включает в себя производство sgRNA посредством транскрипции in vitro , обработки эмбрионов, сборки RNP, электропорации и генотипирования предимплантационных эмбрионов. Исследователь уровня выпускника с минимальным опытом манипулирования эмбрионами может получить генетически отредактированные эмбрионы менее чем за 1 неделю, используя этот протокол. Здесь мы предлагаем простой, недорогой, эффективный, высокопроизводительный метод, который можно использовать с эмбрионами мышей.
Introduction
Редактирование генома у живых мышей было значительно упрощено и стало доступным и более доступным с момента появления редактирования CRISPR 1,2,3. Первоначальные попытки редактирования животных использовали микроинъекцию для доставки мРНК/сгРНК CRISPR Cas9 в эмбрионы пронуклеарной стадии 4,5,6. Хотя микроинъекция довольно эффективна, объем практики, необходимый для ее полного освоения, может не подходить для стажеров и студентов, а также требует дорогостоящего оборудования, которое скромно финансируемая лаборатория не может себе позволить. Микроинъекция обычно выполняется экспертами-техниками на трансгенных объектах с графиками и ценами на услуги, которые ограничивают скорость для многих исследователей. Более доступным подходом является электропорация, которая, как было продемонстрировано, довольно эффективна для доставки CRISPR Cas9 мРНК/сгРНК в эмбрионы пронуклеарной стадии7. Дальнейшие усовершенствования в стратегиях редактирования и доставки генома CRISPR показали, что предварительно собранные RNP, уже связанные с sgRNAs, могут быть эффективным средством снижения мозаицизма8.
Обоснование разработки и использования этого протокола заключалось в том, чтобы обойти многие ограничения и препятствия, связанные с микроинъекцией. Как следует из названия, простой, внутренний и экономически эффективный метод, который мог бы быстро определить, стоит ли использовать непроверенные конструкции сгРНК во время эксперимента с микроинъекцией, был бы очень удобным этапом контроля качества первого прохода (рисунок 1). Хотя этот метод не может заменить микроинъекцию для более сложных стратегий, таких как введение длинных последовательностей донорской ДНК для результатов, основанных на рекомбинации, он идеально подходит для менее сложных стратегий, таких как небольшие делеции или вставки и маркировка генов. Этот метод подходит для исследователей с базовыми навыками манипулирования эмбрионами, которые имеют простые потребности в редактировании, хотели бы проверить свою гипотезу в сроки развития до имплантации или предпочитают тестировать sgRNAs в эмбрионах, прежде чем назначать встречу со специалистом по микроинъекции. Здесь реагенты редактирования временно доставляются в эмбрионы пронуклеарной стадии в виде РНК Cas9/sgRNA посредством электропорации (серия электрических импульсов) для максимизации эффективности при одновременном снижении мозаицизма8. Используя метод генотипирования эмбрионов, результаты редактирования доступны примерно через 1 неделю9, что снижает потребность в различных применениях микроинъекций при значительно сниженных затратах.
Эффективность этого метода достигает пика на стадии пронуклеарного эмбриона, когда эмбрион еще не слил материнскую и отцовскую пронуклеи или не вошел в S-фазу (рисунок 2). Суперовуляция используется для максимизации количества зигот, но производит как пронуклеарные зиготы, так и неоплодотворенные яйцеклетки. Здоровые зиготы также могут быть предварительно отобраны перед электропорацией для повышения общей эффективности. Поскольку другие протоколы электропорации эффективно редактируют зиготы без необходимости включать аналогичную стадию 7,10,11,12,13,14,15, факультативным шагом этого протокола является небольшая эрозия зоны пеллюцидов (ZP). ZP представляет собой слой гликопротеинов, который способствует связыванию сперматозоидов, акросомному ответу и оплодотворению, окружающему эмбрионы пронуклеарной стадии. По нашему опыту, мы обнаружили, что мягкая эрозия ZP на кислотной основе обеспечивает надежную электропорацию Cas9 RNP с лишь незначительным влиянием на жизнеспособность.
Мы наблюдали скорость доставки RNP до 100% эффективности посредством электропорации в штаммах мышей, которые обычно используются в таких исследованиях, как C57BL / 6J и C57BL / 6N 9,16. Независимые группы также разработали процедуры на основе электропорации с эффективностью более или соответствующей микроинъекцией 11,12,13,14,15,17, с протоколами электропорации, хорошо функционирующими у крыс 18,19, свиней 20,21,22 и коров 23 Поэтому мы предлагаем читателям сравнить протоколы, чтобы найти условия, которые наилучшим образом соответствуют их экспериментальным потребностям и потребностям в оборудовании. Система, описанная здесь, использует общие материалы и оборудование, требующие только базовых навыков манипулирования эмбрионами. Этот метод эффективен для целого ряда стратегий редактирования, что делает этот метод широко доступным для исследовательского сообщества.
Проектирование идеальных малых направляющих РНК (sgRNAs) имеет важное значение для эффективного редактирования. Мы рекомендуем проводить скрининг двух-трех стратегий сгРНК на целевой участок непосредственно у эмбрионов мышей, особенно если требуется генерация линии мыши. После разработки рекомендуются методы без клонирования, такие как транскрипция in vitro (IVT) для получения высококачественных sgRNAs3. RNP и sgRNAs смешивают с 30-50 обработанными эмбрионами пронуклеарной стадии и подвергают воздействию серии электрических импульсов, чтобы сначала временно проникнуть в ZP и клеточную мембрану, с последующими импульсами, чтобы держать поры открытыми и электрофоризировать RNP через зиготу24. После оптимизации мы обнаружили, что шесть импульсов 3 мс при 30 В для объемных эмбрионов (~ 50) были оптимальными для эффективности и жизнеспособности редактирования, обеспечивая высокоэффективную доставку РНП Cas9 / sgRNA 9,16,25. События редактирования в отдельных морулах мыши могут быть подтверждены с использованием различных стратегий проверки, общих для редактирования CRISPR, таких как полиморфизм длины фрагмента ограничения (RFLP), переваривание эндонуклеазы T7 и секвенирование Сэнгера интересующей области26.
Текущий метод наиболее подходит для простых схем редактирования (рисунок 3), таких как вставка/удаление (indels), удаление размером с экзон порядка 500-2000 bp, а также доставка точечных мутаций и небольших вставок, таких как C- или N-концевые теги (например, FLAG, HA или V5)9,16,27. Потенциал для сложного редактирования генома, такого как большие вставки флуоресцентных меток или условных аллелей, остается неопределенным и в настоящее время находится в центре внимания предстоящих улучшений.
Этот метод легко осваивается и может быть использован для быстрого тестирования sgRNAs в культивируемых эмбрионах мышей за 1 неделю9 (рисунок 1). Представленный в данной работе шестиступенчатый протокол, который включает в себя 1) проектирование сгРНК; 2) синтез сгРНК; 3) суперовуляция и спаривание; 4) культивирование, сбор и обработка эмбрионов; 5) сборка и электропорация РНП; 6) культивирование эмбрионов и генотипирование. Информация обо всех используемых материалах предоставляется (Таблица материалов). В качестве положительного контроля реагенты для редактирования локуса тирозиназы (Тир) 9,16 были включены в Дополнительную таблицу 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь представлена простая и высокоэффективная технология редактирования генома мыши. Электропорация может быть использована для генерации модифицированных эмбрионов за 1-2 недели (рисунок 1) и может производить отредактированных мышей в течение 6 недель9….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.J.M. создал оригинальную концепцию, которая привела к разработке CRISPR-EZ и произвел цифры. C.K.D. составил и адаптировал внутренние и опубликованные протоколы для этой текущей рукописи. A.J.M. поддерживается NIH (R00HD096108).
Materials
| 0.1-cm-gap electroporation cuvette | Bio-Rad | cat. no. 1652089 | Electroporation |
| 26-G, 1/2-inch needle | BD | cat. no. 305111 | Superovulation |
| 3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice | JAX | cat. no. 000664 | Superovulation |
| 35-mm Tissue culture dish | Greiner Bio-One, | cat. no. 627-160 | Embryo Culture |
| 60-mm Tissue culture dish | Greiner Bio-One, | cat. no. 628-160 | Embryo Processing |
| 6x loading dye | Thermo Fisher Scientific | cat. no. R0611 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade | Sigma-Aldrich, | cat. no. T1788 | Embryo Processing |
| BSA, embryo culture grade | Sigma-Aldrich | cat. no. A3311 | Embryo Processing and Culture |
| Cas9 protein | Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS | cat. no. 1074181 | Electroporation |
| DNase I, RNase-free | New England BioLabs, | cat. no. M0303 | sgRNA Synthesis |
| DPBS(calcium and magnesium free) | Gibco | cat. no. 14190-144 | Embryo Processing |
| EcoRI | NEB | cat. no. R3101S | Genotyping |
| EDTA, anhydrous | Sigma-Aldrich | cat. no. EDS-100G | RNP Buffer |
| Ethanol | Koptec | cat. no. V1016 | sgRNA Synthesis |
| Gelatin (powder) type B, laboratory grade | Fisher, | cat. no. G7-500 | Lysis Buffer |
| Glycerol, molecular-biology grade | Fisher | cat. no. BP229 | RNP Buffer |
| Taq Polymerase | Promega | cat. no. M712 | Genotyping |
| HEPES, cell culture grade | Sigma-Aldrich | cat. no. H4034 | RNP Buffer |
| HinfI (10,000 U/mL) | NEB | cat. no. R0155S | Genotyping |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England BioLabs, | cat. no. E2040 | sgRNA Synthesis |
| Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG) | Millipore | cat. no. 230734 | Superovulation |
| Hyaluronidase/M2 | Millipore | cat. no. MR-051-F | Embryo Processing |
| KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids) | Zenith Biotech | cat. no. ZEKS-050 | Embryo Culture |
| LE agarose, analytical grade | BioExpress | cat. no. E-3120-500 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| M2 medium | Zenith Biotech | cat. no. ZFM2-050 | Embryo Processing |
| Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2) | Sigma-Aldrich | cat. no. M8266 | RNP and Lysis Buffer |
| Mineral Oil | Millipore | cat. no. ES-005C | Embryo Culture |
| Nonidet P-40,substitute (NP-40) | Sigma-Aldrich | cat. no. 74385 | Lysis Buffer |
| Nuclease-free water, molecular-biology grade | Ambion | cat. no. AM9937 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping | Integrated DNA Technologies | custom orders | sgRNA Design |
| Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | cat. no. 31985062 | Embryo Culture |
| High-fidelity DNA polymerase | New England BioLabs, | cat. no. M0530 | sgRNA Synthesis |
| Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl) | Sigma-Aldrich | cat. no. P9333 | RNP and Lysis Buffer |
| Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG) | ProspecBio | cat. no. HOR-272 | Superovulation |
| Proteinase K, molecular-biology grade | Fisher | cat. no. BP1700-100 | Lysis Buffer |
| RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube | VWR | cat. no. 20170-333 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| RNase-free eight-well PCR strip tubes | VWR | cat. no. 82006-606 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| Magnetic purification beads | GE Healthcare | cat. no. 65152105050250 | sgRNA Synthesis |
| Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | cat. no. C4706 | RNP Buffer |
| Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade | Teknova | cat. no. T1085 | Lysis Buffer |
| Tween 20 molecular-biology grade | Sigma-Aldrich | cat. no. P7949-500 | Lysis Buffer |
References
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
- Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
- Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. Biotechniques. 59 (4), 201-208 (2015).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
- Fujii, W., Onuma, A., Sugiura, K., Naito, K. One-step generation of phenotype-expressing triple-knockout mice with heritable mutated alleles by the CRISPR/Cas9 system. Journal of Reproduction and Development. 60 (4), 324-327 (2014).
- Kaneko, T., et al. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
- Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).
- Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
- Gurumurthy, C. B., et al. Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD. Nature Protocols. 14 (8), 2452-2482 (2019).
- Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34 (8), 807-808 (2016).
- Tröder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), 0196891 (2018).
- Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -. F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation. Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Remy, S., et al. Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation. Scientific Reports. 7, 16554 (2017).
- Tanihara, F., et al. Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation. Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).
- Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes. Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).
- Nishio, K., et al. Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos. Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).
- Camargo, L. S. A., Owen, J. R., van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Frontiers in Genetics. 11, 570069 (2020).
- Escoffre, J. M., et al. What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues. Molecular Biotechnology. 41 (3), 286-295 (2009).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
- Modzelewski, A. J., et al. A mouse-specific retrotransposon drives a conserved Cdk2ap1 isoform essential for development. Cell. 184 (22), 5541-5558 (2021).
- Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
- Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 14811 (2019).
- Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. Journal of Visualized Experiments. (3), e185 (2007).
- Takahashi, G., et al. GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice. Scientific Reports. 5, 11406 (2015).
- Tu, Z., et al. Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos. Scientific Reports. 7, 42081 (2017).
- Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16 (1), 87 (2015).
- Zhu, L., et al. Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes. BMC Genomics. 10, 47 (2009).
- Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
- Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. Designing and generating a mouse model: frequently asked questions. Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).
- Nakajima, K., et al. Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system. Scientific Reports. 6, 34703 (2016).
- Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nature Methods. 12 (6), 479 (2015).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
