Automatische Bildverarbeitung zur Bestimmung der Gemeinschaftsgrößenstruktur von Flussmakroinvertebraten
Summary
Der Artikel basiert auf der Erstellung eines angepassten Protokolls zum Scannen, Erkennen, Sortieren und Identifizieren digitalisierter Objekte, die benthischen Flussmakroinvertebraten entsprechen, unter Verwendung eines halbautomatischen Bildgebungsverfahrens. Dieses Verfahren ermöglicht die Erfassung der individuellen Größenverteilungen und Größenmetriken einer Makroinvertebratengemeinschaft in ca. 1 h.
Abstract
Die Körpergröße ist ein wichtiges funktionelles Merkmal, das als Bioindikator verwendet werden kann, um die Auswirkungen von Störungen in natürlichen Lebensgemeinschaften zu bewerten. Die Struktur der Gemeinschaftsgröße reagiert auf biotische und abiotische Gradienten, einschließlich anthropogener Störungen zwischen Taxa und Ökosystemen. Die manuelle Messung von kleinwüchsigen Organismen wie benthischen Makroinvertebraten (z.B. >500 μm bis wenige Zentimeter lang) ist jedoch zeitaufwendig. Um die Schätzung der Populationsgröße zu beschleunigen, haben wir hier ein Protokoll entwickelt, um die individuelle Körpergröße von konservierten Flussmakroinvertebraten halbautomatisch zu messen, die einer der am häufigsten verwendeten Bioindikatoren zur Beurteilung des ökologischen Zustands von Süßwasserökosystemen sind. Dieses Protokoll basiert auf einer bestehenden Methodik, die entwickelt wurde, um marines Mesozooplankton mit einem Scansystem für Wasserproben zu scannen. Das Protokoll besteht aus drei Hauptschritten: (1) Scannen von Teilproben (feine und grobe Probengrößenfraktionen) von Flussmakroinvertebraten und Verarbeitung der digitalisierten Bilder, um jedes detektierte Objekt in jedem Bild zu individualisieren; (2) Erstellen, Auswerten und Validieren eines Lernsets durch künstliche Intelligenz, um die einzelnen Bilder von Makroinvertebraten halbautomatisch von Detritus und Artefakten in den gescannten Proben zu trennen; und (3) die Darstellung der Größenstruktur der Makroinvertebratengemeinschaften. Neben dem Protokoll enthält diese Arbeit die Kalibrierungsergebnisse und listet mehrere Herausforderungen und Empfehlungen auf, um das Verfahren an Makroinvertebratenproben anzupassen und für weitere Verbesserungen in Betracht zu ziehen. Insgesamt unterstützen die Ergebnisse den Einsatz des vorgestellten Scanning-Systems für die automatische Körpergrößenmessung von Flussmakroinvertebraten und legen nahe, dass die Darstellung ihres Größenspektrums ein wertvolles Werkzeug für die schnelle Biobewertung von Süßwasserökosystemen ist.
Introduction
Benthische Makroinvertebraten werden häufig als Bioindikatoren verwendet, um den ökologischen Zustand von Gewässern zu bestimmen1. Die meisten Indizes zur Beschreibung von Makroinvertebratengemeinschaften konzentrieren sich auf taxonomische Metriken. Neue biologische Bewertungsinstrumente, die die Körpergröße integrieren, werden jedoch gefördert, um eine alternative oder ergänzende Perspektive zu taxonomischen Ansätzen zu bieten 2,3.
Die Körpergröße gilt als Metamerkmal, das mit anderen lebenswichtigen Merkmalen wie Stoffwechsel, Wachstum, Atmung und Bewegung zusammenhängt4. Darüber hinaus kann die Körpergröße die trophische Position und die Wechselwirkungen bestimmen5. Die Beziehung zwischen der individuellen Körpergröße und der normalisierten Biomasse (oder Häufigkeit) nach Größenklasse in einer Gemeinschaft ist definiert als das Größenspektrum6 und folgt dem allgemeinen Muster einer linearen Abnahme der normalisierten Biomasse mit zunehmender individueller Größe auf einer logarithmischen Skala7. Die Steigung dieser linearen Beziehung wurde ausführlich theoretisch untersucht, und empirische Studien über Ökosysteme hinweg haben sie als ökologischen Indikator für die Größe der Gemeinschaftverwendet 4. Ein weiterer synthetischer Indikator für die Struktur der Gemeinschaftsgröße, der erfolgreich in Studien zur Biodiversität und zum Funktionieren von Ökosystemen verwendet wurde, ist die Diversität der Gemeinschaftsgröße, die als Shannon-Index der Größenklassen des Größenspektrums oder seines Analogons dargestellt wird, der auf der Grundlage der individuellen Größenverteilungen berechnet wird8.
In Süßwasserökosystemen wird die Größenstruktur verschiedener Faunengruppen als ataktischer Indikator verwendet, um die Reaktion biotischer Lebensgemeinschaften auf Umweltgradienten 9,10,11 und auf anthropogene Störungen 12,13,14,15,16 zu bewerten. Makroinvertebraten sind keine Ausnahme, und ihre Größenstruktur reagiert auch auf Umweltveränderungen17,18 und anthropogene Störungen wie Bergbau 19, Landnutzung 20 oder Stickstoff (N) und Phosphor (P) Anreicherung20,21,22. Die Messung von Hunderten von Individuen zur Beschreibung der Gemeindegrößenstruktur ist jedoch eine mühsame und zeitraubende Aufgabe, die als Routinemessung in Laboratorien aus Zeitmangel oft vermieden wird. So wurden mehrere halbautomatische oder automatische Bildgebungsverfahren zur Klassifizierung und Vermessung von Proben entwickelt23,24,25,26. Die meisten dieser Methoden konzentrieren sich jedoch mehr auf die taxonomische Klassifizierung als auf die individuelle Größe der Organismen und sind nicht für alle Arten von Makroinvertebraten einsatzbereit. In der marinen Planktonökologie wurde ein Scanning-Bildanalysesystem ausgiebig eingesetzt, um die Größe und taxonomische Zusammensetzung von Zooplanktongemeinschaften zu bestimmen 27,28,29,30,31. Dieses Instrument ist in mehreren Meeresinstituten weltweit zu finden und wird verwendet, um konservierte Zooplanktonproben zu scannen, um hochauflösende digitale Bilder der gesamten Probe zu erhalten. Das vorliegende Protokoll passt die Verwendung dieses Instruments an, um das Größenspektrum der Makroinvertebratengemeinschaften in Flüssen schnell und automatisch abzuschätzen, ohne in die Entwicklung eines neuen Geräts zu investieren.
Das Protokoll besteht darin, eine Probe zu scannen und das gesamte Bild zu verarbeiten, um automatisch einzelne Bilder (d.h. Vignetten) der Objekte in der Probe zu erhalten. Mehrere Messungen von Form, Größe und Graustufenmerkmalen charakterisieren jedes Objekt und ermöglichen die automatische Klassifizierung der Objekte in Kategorien, die dann von einem Experten validiert werden. Die individuelle Größe jedes Organismus wird anhand des ellipsoiden Biovolumens (mm3) berechnet, das sich aus der in Pixeln gemessenen Fläche des Organismus ableitet. Dies ermöglicht es, das Größenspektrum der Probe schnell zu erhalten. Nach unserem besten Wissen wurde dieses Scanning-Imaging-System nur zur Verarbeitung von Mesozooplanktonproben verwendet, aber das Gerät könnte möglicherweise die Arbeit mit benthischen Süßwasser-Makroinvertebraten ermöglichen.
Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist es daher, eine Methode einzuführen, mit der die individuelle Größe von konservierten Flussmakroinvertebraten schnell ermittelt werden kann, indem ein bestehendes Protokoll angepasst wird, das zuvor mit marinem Mesozooplankton 27,32,33 verwendet wurde. Das Verfahren besteht aus einem halbautomatischen Ansatz, der mit einem Scangerät zum Scannen von Wasserproben und drei offenen Programmen zur Verarbeitung der gescannten Bilder arbeitet. Ein angepasstes Protokoll zum Scannen, Erkennen und Identifizieren digitalisierter Flussmakroinvertebraten zur automatischen Erfassung der Gemeinschaftsgrößenstruktur und der damit verbundenen Größenmetriken wird hierin vorgestellt. Die Bewertung des Verfahrens und die Leitlinien zur Steigerung der Effizienz werden auch auf der Grundlage von 42 gescannten Bildern von Proben von Makroinvertebraten aus Flüssen vorgestellt, die aus drei Becken auf der nordöstlichen (nordöstlichen) Iberischen Halbinsel (Ter, Segre-Ebre und Besòs) entnommen wurden.
Die Proben wurden in 100 m langen Flussabschnitten nach dem Protokoll der spanischen Regierung für Feldproben und Laboranalysen von benthischen Flussmakroinvertebraten in durchfahrbaren Flüssen gesammelt34. Die Proben wurden mit einem Surber-Probenehmer (Rahmen: 0,3 m x 0,3 m, Maschenweite: 250 μm) nach einer Multi-Habitat-Befragung gesammelt. Im Labor wurden die Proben gereinigt und durch ein 5 mm und ein 500 μm Maschen gesiebt, um zwei Teilproben zu erhalten: eine grobe Teilprobe (5 mm Maschen) und eine feine Teilprobe (500 μm Maschen), die in separaten Fläschchen gelagert und in 70% Ethanol konserviert wurden. Die Aufteilung der Probe in zwei Größenfraktionen ermöglicht eine bessere Schätzung der Struktur der Gemeinschaftsgröße, da große Organismen seltener und seltener sind als die kleinen Organismen. Andernfalls weist die gescannte Probe eine verzerrte Darstellung der großen Größenfraktion auf.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Anpassung der von Gorsky et al. 2010 beschriebenen Methodik für Flussmakroinvertebraten ermöglicht eine hohe Klassifikationsgenauigkeit bei der Schätzung der Gemeinschaftsgrößenstruktur bei Süßwasser-Makroinvertebraten. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Protokoll die Zeit für die Schätzung der individuellen Größenstruktur in einer Probe auf etwa 1 Stunde reduzieren kann. Daher soll das vorgeschlagene Protokoll die routinemäßige Verwendung von Größenspektren von Makroinvertebraten als schnellen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom spanischen Ministerium für Wissenschaft, Innovation und Universitäten unterstützt (Förderkennzeichen RTI2018-095363-B-I00). Wir danken den CERM-UVic-UCC-Mitgliedern Èlia Bretxa, Anna Costarrosa, Laia Jiménez, María Isabel González, Marta Jutglar, Francesc Llach und Núria Sellarès für ihre Arbeit bei der Probenahme und Laborsortierung von Makroinvertebraten und David Albesa für die Mitarbeit bei der Probensuche. Abschließend danken wir Josep Maria Gili und dem Institut de Ciències del Mar (ICM-CSIC) für die Nutzung der Laboreinrichtungen und des Scanners.
Materials
| Beaker | Labbox | Other containers could be used | |
| Dionized water | Icopresa | 8420239600123 | To dilute the ethanol |
| Funnel | Vitlab | 41094 | |
| Glass vials 8 ml | Labbox | SVSN-C10-195 | 1 vial/subsample |
| ImageJ Software | Free access | Version 4.41o/ Image processing software | |
| Large frame | Hydroptic | Provided by ZooScan | 24.5 cm x 15.8 cm |
| Monalcol 96 (Ethanol 96) | Montplet | 1050JE001 | |
| Plankton Identifier Software | Free access | Version 1.2.6/ Automatic identification software | |
| Sieve | Cisa | 26852.2 | Nominal aperture 500µ and nominal aperture 0,5 cm |
| Tweezers | Bondline | B5SA | Stainless, anti-magnetic, anti-acid |
| VueScan 9 x 64 (9.5.09) Software | Hydroptic | Version 9.0.51/ Sacn software | |
| Wooden needle | Any plastic or wood needle can be used | ||
| Zooprocess Software | Free access | Version 7.14/Image processing software | |
| ZooScan | Hydroptic | 54 | Version III/ Scanner |
Referências
- Birk, S., et al. Three hundred ways to assess Europe’s surface waters: An almost complete overview of biological methods to implement the Water Framework Directive. Ecological Indicators. 18, 31-41 (2012).
- Basset, A., Sangiorgio, F., Pinna, M. Monitoring with benthic macroinvertebrates: advantages and disadvantages of body size descriptors. Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems. 14, S43-S58 (2004).
- Reyjol, Y., et al. Assessing the ecological status in the context of the European Water Framework Directive: Where do we go now. Science of the Total Environment. 497-498, 332-344 (2014).
- Brown, J. H., Gillooly, J. F., Allen, A. P., Savage, V. M., West, G. B. Toward a metabolic theory of ecology. Ecology. 85 (7), 1771-1789 (2004).
- Woodward, G., et al. Body size in ecological networks. Trends in Ecology & Evolution. 20 (7), 402-409 (2005).
- Sprules, W. G., Barth, L. E. Surfing the biomass size spectrum: Some remarks on history, theory, and application. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (4), 477-495 (2016).
- White, E. P., Ernest, S. K. M., Kerkhoff, A. J., Enquist, B. J. Relationships between body size and abundance in ecology. Trends in Ecology & Evolution. 22 (6), 323-330 (2007).
- Quintana, X. D., et al. A nonparametric method for the measurement of size diversity with emphasis on data standardization. Limnology and Oceanography – Methods. 6 (1), 75-86 (2008).
- Blanchard, J. L., Heneghan, R. F., Everett, J. D., Trebilco, R., Richardson, A. J. From bacteria to whales: Using functional size spectra to model marine ecosystems. Trends in Ecology & Evolution. 32 (3), 174-186 (2017).
- Petchey, O. L., Belgrano, A. Body-size distributions and size-spectra: Universal indicators of ecological status. Biology Letters. 6 (4), 434-437 (2010).
- Emmrich, M., et al. Geographical patterns in the body-size structure of European lake fish assemblages along abiotic and biotic gradients. Journal of Biogeography. 41 (12), 2221-2233 (2014).
- Arranz, I., Brucet, S., Bartrons, M., García-Comas, C., Benejam, L. Fish size spectra are affected by nutrient concentration and relative abundance of non-native species across streams on the NE Iberian Peninsula. Science of the Total Environment. 795, 148792 (2021).
- Vila-Martínez, N., Caiola, N., Ibáñez, C., Benejam, L. l., Brucet, S. Normalized abundance spectra of the fish community reflect hydropeaking on a Mediterranean large river. Ecological Indicators. 97, 280-289 (2019).
- Benejam, L. l., Tobes, I., Brucet, S., Miranda, R. Size spectra and other size-related variables of river fish communities: systematic changes along the altitudinal gradient on pristine Andean streams. Ecological Indicators. 90, 366-378 (2018).
- Sutton, I. A., Jones, N. E. Measures of fish community size structure as indicators for stream monitoring programs. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 77 (5), 824-835 (2019).
- Murry, B. A., Farrell, J. M. Resistance of the size structure of the fish community to ecological perturbations in a large river ecosystem. Freshwater Biology. 59, 155-167 (2014).
- Townsend, C. R., Thompson, R. M., Hildrew, A. G., Raffaelli, D. G., Edmonds-Brown, R. Body size in streams: Macroinvertebrate community size composition along natural and human-induced environmental gradients. In Body Size: The Structure and Function of Aquatic Ecosystems. , (2007).
- Gjoni, V., et al. Patterns of functional diversity of macroinvertebrates across three aquatic ecosystem types, NE Mediterranean. Mediterranean Marine Science. 20 (4), 703-717 (2019).
- Pomeranz, J. P. F., Warburton, H. J., Harding, J. S. Anthropogenic mining alters macroinvertebrate size spectra in streams. Freshwater Biology. 64 (1), 81-92 (2019).
- García-Girón, J., et al. Anthropogenic land-use impacts on the size structure of macroinvertebrate assemblages are jointly modulated by local conditions and spatial processes. Environmental Research. 204, 112055 (2022).
- Demi, L. M., Benstead, J. P., Rosemond, A. D., Maerz, J. C. Experimental N and P additions alter stream macroinvertebrate community composition via taxon-level responses to shifts in detrital resource stoichiometry. Functional Ecology. 33 (5), 855-867 (2019).
- Basset, A., et al. A benthic macroinvertebrate size spectra index for implementing the Water Framework Directive in coastal lagoons in Mediterranean and Black Sea ecoregions. Ecological Indicators. 12 (1), 72-83 (2012).
- Ärje, J., et al. Automatic image-based identification and biomass estimation of invertebrates. Methods in Ecology and Evolution. 11 (8), 922-931 (2020).
- Raitoharju, J., et al. Benchmark database for fine-grained image classification of benthic macroinvertebrates. Image and Vision Computing. 78, 73-83 (2018).
- Lytle, D. A., et al. Automated processing and identification of benthic invertebrate samples. Journal of the North American Benthological Society. 29 (3), 867-874 (2010).
- Serna, J. P., Fernández, D. S., Vélez, F. J., Aguirre, N. J. An image processing method for recognition of four aquatic macroinvertebrates genera in freshwater environments in the Andean region of Colombia. Environmental Monitoring and Assessment. 192, 617 (2020).
- Gorsky, G., et al. Digital zooplankton image analysis using the ZooScan integrated system. Journal of Plankton Research. 32 (3), 285-303 (2010).
- Marcolin, C. R., Schultes, S., Jackson, G. A., Lopes, R. M. Plankton and seston size spectra estimated by the LOPC and ZooScan in the Abrolhos Bank ecosystem (SE Atlantic). Continental Shelf Research. 70, 74-87 (2013).
- Silva, N., Marcolin, C. R., Schwamborn, R. Using image analysis to assess the contributions of plankton and particles to tropical coastal ecosystems. Estuarine, Coast and Shelf Science. 219, 252-261 (2019).
- Vandromme, P., et al. Assessing biases in computing size spectra of automatically classified zooplankton from imaging systems: A case study with the ZooScan integrated system. Methods in Oceanography. 1-2, 3-21 (2012).
- Naito, A., et al. Surface zooplankton size and taxonomic composition in Bowdoin Fjord, north-western Greenland: A comparison of ZooScan, OPC and microscopic analyses. Polar Science. 19, 120-129 (2019).
- . Zooprocess/Plankton Identifier protocol for computer assisted zooplankton sorting Available from: https://manualzz.com/doc/43116355/zooprocess—plankton-identifier-protocol-for (2013)
- Protocolo de muestreo y laboratorio de fauna bentónica de invertebrados en ríos vadeables. CÓDIGO: ML-Rv-I-2013. Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente Available from: https://www.miteco.gob.es/es/agua/temas/estado-y-calidad-de-las-aguas/ML-Rv-I-2013_Muestreo%20y%20laboratorio_Fauna%20bent%C3%B3nica%20de%20de%20invertebrado_%20R%C3%Ados%20vadeables_24_05_2013_tcm30-175284.pdf (2013)
- García-Comas, C., et al. Prey size diversity hinders biomass trophic transfer and predator size diversity promotes it in planktonic communities. Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 283 (1824), 20152129 (2016).
- García-Comas, C., et al. Mesozooplankton size structure in response to environmental conditions in the East China Sea: How much does size spectra theory fit empirical data of a dynamic coastal area. Progress in Oceanography. 121, 141-157 (2014).
- Marquina, D., Buczek, M., Ronquist, F., Lukasik, P. The effect of ethanol concentration on the morphological and molecular preservation of insects for biodiversity studies. PeerJ. 9, 10799 (2021).
- Bell, J. L., Hopcroft, R. R. Assessment of ZooImage as a tool for the classification of zooplankton. Journal of Plankton Research. 30 (12), 1351-1367 (2008).
- Colas, F., et al. The ZooCAM, a new in-flow imaging system for fast onboard counting, sizing and classification of fish eggs and metazooplankton. Progress in Oceanography. 166, 54-65 (2018).
- Bachiller, E., Fernandes, J. A., Irigoien, X. Improving semiautomated zooplankton classification using an internal control and different imaging devices. Limnology and Oceanography Methods. 10 (1), 1-9 (2012).
