Processamento Automático de Imagem para Determinar a Estrutura do Tamanho da Comunidade de Macroinvertebrados Ribeirinhos
Summary
O artigo baseia-se na criação de um protocolo adaptado para escanear, detectar, classificar e identificar objetos digitalizados correspondentes a macroinvertebrados de rios bentônicos usando um procedimento de imagem semiautomático. Este procedimento permite a aquisição das distribuições de tamanho individual e métricas de tamanho de uma comunidade de macroinvertebrados em cerca de 1 h.
Abstract
O tamanho do corpo é um traço funcional importante que pode ser usado como um bioindicador para avaliar os impactos das perturbações nas comunidades naturais. A estrutura do tamanho da comunidade responde a gradientes bióticos e abióticos, incluindo perturbações antropogênicas entre táxons e ecossistemas. No entanto, a medição manual de organismos de corpo pequeno, como macroinvertebrados bentônicos (por exemplo, >500 μm a alguns centímetros de comprimento) é demorada. Para agilizar a estimativa da estrutura do tamanho da comunidade, desenvolvemos um protocolo para medir semi-automaticamente o tamanho corporal individual de macroinvertebrados de rios preservados, que são um dos bioindicadores mais comumente usados para avaliar o estado ecológico dos ecossistemas de água doce. Este protocolo é adaptado de uma metodologia existente desenvolvida para escanear o mesozooplâncton marinho com um sistema de varredura projetado para amostras de água. O protocolo consiste em três etapas principais: (1) varredura de subamostras (frações amostrais finas e grosseiras) de macroinvertebrados fluviais e processamento das imagens digitalizadas para individualizar cada objeto detectado em cada imagem; (2) criar, avaliar e validar um conjunto de aprendizagem através de inteligência artificial para separar semi-automaticamente as imagens individuais de macroinvertebrados de detritos e artefatos nas amostras digitalizadas; e (3) representando a estrutura de tamanho das comunidades de macroinvertebrados. Além do protocolo, este trabalho inclui os resultados da calibração e enumera vários desafios e recomendações para adaptar o procedimento a amostras de macroinvertebrados e considerar novas melhorias. No geral, os resultados apoiam o uso do sistema de varredura apresentado para a medição automática do tamanho corporal de macroinvertebrados fluviais e sugerem que a representação de seu espectro de tamanho é uma ferramenta valiosa para a rápida bioavaliação de ecossistemas de água doce.
Introduction
Os macroinvertebrados bentônicos são amplamente utilizados como bioindicadores para determinar o estado ecológico dos corpos d’água1. A maioria dos índices para descrever comunidades de macroinvertebrados se concentra em métricas taxonômicas. No entanto, novas ferramentas de bioavaliação que integrem o tamanho corporal são encorajadas a fornecer uma perspectiva alternativa ou complementar às abordagens taxonômicas 2,3.
O tamanho corporal é considerado um metatraço relacionado a outros traços vitais, como metabolismo, crescimento, respiração e movimento4. Além disso, o tamanho do corpo pode determinar a posição trófica e as interações5. A relação entre o tamanho corporal individual e a biomassa normalizada (ou abundância) por classe de tamanho em uma comunidade é definida como o espectro de tamanho6 e segue o padrão geral de uma diminuição linear da biomassa normalizada à medida que o tamanho individual aumenta em uma escala logarítmica7. A inclinação dessa relação linear tem sido extensivamente estudada teoricamente, e estudos empíricos em ecossistemas a têm utilizado como um indicador ecológico da estrutura de tamanho da comunidade4. Outro indicador sintético da estrutura de tamanho da comunidade que tem sido usado com sucesso em estudos de funcionamento da biodiversidade-ecossistema é a diversidade de tamanho da comunidade, que é representada como o índice de Shannon das classes de tamanho do espectro de tamanho ou seu analógico, que é calculado com base nas distribuições de tamanho individuais8.
Em ecossistemas de água doce, a estrutura de tamanho de diferentes grupos faunísticos é utilizada como indicador atáxico para avaliar a resposta de comunidades bióticas a gradientes ambientais 9,10,11 e a perturbações antrópicas 12,13,14,15,16. Os macroinvertebrados não são uma exceção, e sua estrutura de tamanho também responde a mudanças ambientais17,18 e perturbações antropogênicas, como mineração 19, uso da terra 20 ou enriquecimento de nitrogênio (N) e fósforo (P)20,21,22. No entanto, medir centenas de indivíduos para descrever a estrutura do tamanho da comunidade é uma tarefa tediosa e demorada que muitas vezes é evitada como uma medição de rotina em laboratórios devido à falta de tempo. Assim, vários métodos de imagem semiautomáticos ou automáticos para classificar e medir espécimes têm sido desenvolvidos23,24,25,26. No entanto, a maioria desses métodos está focada na classificação taxonômica mais do que no tamanho individual dos organismos e não está pronta para uso em todos os tipos de macroinvertebrados. Na ecologia do plâncton marinho, um sistema de análise de imagens de varredura tem sido amplamente utilizado para determinar o tamanho e a composição taxonômica de comunidades de zooplâncton 27,28,29,30,31. Este instrumento pode ser encontrado em vários institutos marinhos em todo o mundo, e é usado para digitalizar amostras de zooplâncton preservadas para obter imagens digitais de alta resolução de toda a amostra. O presente protocolo adapta o uso deste instrumento para estimar o tamanho do espectro da comunidade de macroinvertebrados em rios de forma rápida e automática, sem investir na criação de um novo dispositivo.
O protocolo consiste em digitalizar uma amostra e processar toda a imagem para obter automaticamente imagens únicas (ou seja, vinhetas) dos objetos na amostra. Várias medidas de forma, tamanho e características de nível de cinza caracterizam cada objeto e permitem a classificação automática dos objetos em categorias, que são então validadas por um especialista. O tamanho individual de cada organismo é calculado usando o biovolume elipsoidal (mm3), que é derivado da área do organismo medida em pixels. Isso permite obter o espectro de tamanho da amostra de maneira rápida. Até onde sabemos, este sistema de imagem de varredura só foi usado para processar amostras de mesozooplâncton, mas o dispositivo pode potencialmente permitir o trabalho com macroinvertebrados bentônicos de água doce.
O objetivo geral deste estudo é, portanto, introduzir um método para obter rapidamente o tamanho individual de macroinvertebrados fluviais preservados, adaptando um protocolo existente anteriormente utilizado com mesozooplâncton marinho 27,32,33. O procedimento consiste em usar uma abordagem semiautomática que opera com um dispositivo de digitalização para digitalizar amostras de água e três softwares abertos para processar as imagens digitalizadas. Um protocolo adaptado para digitalizar, detectar e identificar macroinvertebrados fluviais digitalizados para adquirir automaticamente a estrutura de tamanho da comunidade e as métricas de tamanho relacionadas é aqui apresentado. A avaliação do procedimento e as orientações para aumentar a eficiência também são apresentadas com base em 42 imagens digitalizadas de amostras de macroinvertebrados ribeirinhos coletadas de três bacias do Nordeste (NE) da Península Ibérica (Ter, Segre-Ebre e Besòs).
As amostras foram coletadas em trechos de rios de 100 m seguindo o protocolo de amostragem de campo e análise laboratorial de macroinvertebrados de rios bentônicos em rios transbordáveis do Governo Espanhol34. As amostras foram coletadas com um amostrador de surber (quadro: 0,3 m x 0,3 m, malha: 250 μm) após um levantamento multi-habitat. No laboratório, as amostras foram limpas e peneiradas através de uma malha de 5 mm e 500 μm para obtenção de duas subamostras: uma subamostra grossa (malha de 5 mm) e uma subamostra fina (malha de 500 μm), que foram armazenadas em frascos separados e preservadas em etanol a 70%. Separar a amostra em duas frações de tamanho permite uma melhor estimativa da estrutura de tamanho da comunidade, uma vez que os organismos grandes são mais raros e menores do que os organismos pequenos. Caso contrário, a amostra digitalizada tem uma representação tendenciosa da fração de tamanho grande.
Protocol
Representative Results
Discussion
A adaptação da metodologia descrita por Gorsky et al. 2010 para macroinvertebrados ribeirinhos permite alta acurácia de classificação na estimativa da estrutura do tamanho da comunidade em macroinvertebrados de água doce. Os resultados sugerem que o protocolo pode reduzir o tempo para estimar a estrutura de tamanho individual em uma amostra para cerca de 1 hora. Assim, o protocolo proposto pretende promover o uso rotineiro de espectros de tamanho de macroinvertebrados como um bioindicador rápido e integrador para …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Ciência, Inovação e Universidades espanholas (número de intervenção RTI2018-095363-B-I00). Agradecemos aos membros do CERM-UVic-UCC Èlia Bretxa, Anna Costarrosa, Laia Jiménez, María Isabel González, Marta Jutglar, Francesc Llach e Núria Sellarès por seu trabalho em amostragem de campo de macroinvertebrados e triagem laboratorial e a David Albesa por colaborar na digitalização de amostras. Finalmente, agradecemos a Josep Maria Gili e ao Institut de Ciències del Mar (ICM-CSIC) pelo uso das instalações laboratoriais e do dispositivo de scanner.
Materials
| Beaker | Labbox | Other containers could be used | |
| Dionized water | Icopresa | 8420239600123 | To dilute the ethanol |
| Funnel | Vitlab | 41094 | |
| Glass vials 8 ml | Labbox | SVSN-C10-195 | 1 vial/subsample |
| ImageJ Software | Free access | Version 4.41o/ Image processing software | |
| Large frame | Hydroptic | Provided by ZooScan | 24.5 cm x 15.8 cm |
| Monalcol 96 (Ethanol 96) | Montplet | 1050JE001 | |
| Plankton Identifier Software | Free access | Version 1.2.6/ Automatic identification software | |
| Sieve | Cisa | 26852.2 | Nominal aperture 500µ and nominal aperture 0,5 cm |
| Tweezers | Bondline | B5SA | Stainless, anti-magnetic, anti-acid |
| VueScan 9 x 64 (9.5.09) Software | Hydroptic | Version 9.0.51/ Sacn software | |
| Wooden needle | Any plastic or wood needle can be used | ||
| Zooprocess Software | Free access | Version 7.14/Image processing software | |
| ZooScan | Hydroptic | 54 | Version III/ Scanner |
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