Humane microglia-achtige cellen: differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen en in vitro live-cel fagocytosetest met behulp van humane synaptosomen
Summary
Dit protocol beschrijft het differentiatieproces van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) in microglia-achtige cellen voor in vitro experimenten. We nemen ook een gedetailleerde procedure op voor het genereren van menselijke synaptosomen uit iPSC-afgeleide lagere motorneuronen die kunnen worden gebruikt als substraat voor in vitro fagocytosetests met behulp van live-cell imaging-systemen.
Abstract
Microglia zijn de residente immuuncellen van myeloïde oorsprong die homeostase in de micro-omgeving van de hersenen handhaven en een belangrijke speler zijn geworden bij meerdere neurologische ziekten. Het bestuderen van menselijke microglia in gezondheid en ziekte vormt een uitdaging vanwege het extreem beperkte aanbod van menselijke cellen. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) afgeleid van menselijke individuen kunnen worden gebruikt om deze barrière te omzeilen. Hier wordt gedemonstreerd hoe menselijke iPSC’s kunnen worden gedifferentieerd in microglia-achtige cellen (iMG’s) voor in vitro experimenten. Deze iMG’s vertonen de verwachte en fysiologische eigenschappen van microglia, waaronder microglia-achtige morfologie, expressie van de juiste markers en actieve fagocytose. Daarnaast wordt documentatie verstrekt voor het isoleren en labelen van synaptosoomsubstraten afgeleid van menselijke iPSC-afgeleide lagere motorneuronen (i3LMN’s). Een live-cell, longitudinale beeldvormingstest wordt gebruikt om de overspoeling van menselijke synaptosomen gelabeld met een pH-gevoelige kleurstof te monitoren, waardoor onderzoek naar de fagocytische capaciteit van iMG mogelijk is. De hierin beschreven protocollen zijn breed toepasbaar op verschillende gebieden die de menselijke microgliabiologie en de bijdrage van microglia aan ziekten onderzoeken.
Introduction
Microglia zijn de residente immuuncellen in het centrale zenuwstelsel (CZS) en spelen een cruciale rol bij de ontwikkeling van het CZS. Microglia zijn ook belangrijk in de volwassen hersenen voor het handhaven van homeostase en het actief reageren op trauma- en ziekteprocessen. Cumulatief bewijs toont aan dat microglia een belangrijke bijdrage leveren aan de pathogenese van meerdere neurologische en neurodegeneratieve ziekten 1,2. Hoewel de huidige kennis over microgliale biologie voornamelijk is afgeleid van muismodellen, hebben recente studies belangrijke verschillen tussen muizen- en menselijke microglia opgehelderd, wat de noodzaak onderstreept van het ontwikkelen van technologieën om de genetica en biologische functies van menselijke microglia te bestuderen 3,4. Isolatie van microglia uit ontleed primair weefsel kan microglia-eigenschappen ernstig wijzigen5, waardoor de resultaten die met dergelijke cellen worden verkregen, mogelijk worden verstoord. Het algemene doel van deze methode is om menselijke iPSC’s te differentiëren in iMG’s, waardoor een celkweeksysteem wordt geboden om menselijke microglia onder basale omstandigheden te bestuderen. Bovendien is een fagocytosetest met behulp van een volledig menselijk modelsysteem hierin opgenomen als een middel om de functionaliteit van iMG’s te bestuderen, zowel als een kwaliteitscontrolemaatstaf als om iMG-disfunctie in de context van ziekte te beoordelen.
Meerdere protocollen voor microglia differentiatie van iPSC’s zijn onlangs in de literatuur naar voren gekomen 6,7,8,9,10. Mogelijke nadelen van sommige protocollen zijn langere of lange perioden van differentiatie, de toevoeging van meerdere groeifactoren en/of complexe experimentele procedures 6,9,10. Hier wordt een “gebruiksvriendelijke” differentiatiemethode aangetoond die aspecten van microglia-ontogenie recapituuleert door differentiatie van iPSC’s in voorlopercellen die primitieve macrofaagprecursoren (PMP’s) worden genoemd)7,11. PMP’s worden gegenereerd zoals eerder beschreven, met enkele optimalisaties hierin gepresenteerd12. De PMP’s bootsen MYB-onafhankelijke dooier-zak-afgeleide macrofagen na, die tijdens de embryonale ontwikkeling microglia veroorzaken door de hersenen binnen te dringen vóór de sluiting van de bloed-hersenbarrière13. Om PMP’s terminaal te differentiëren in iMG’s, gebruikten we een snelle en vereenvoudigde monocultuurmethode op basis van protocollen van Haenseler et al. en Brownjohn et al., met enkele aanpassingen om een efficiënte microgliadifferentiatiemethode te genereren waarin iMG’s robuust microglia-verrijkte markers tot expressie brengen 7,8. Deze differentiatiemethode kan worden gereproduceerd in laboratoria met expertise in de cultuur van iPSC’s en met onderzoeksdoelen gericht op het bestuderen van microgliabiologie met behulp van een menselijk modelsysteem.
iPSC-afgeleide microglia vormen een biologisch relevante bron van menselijke microglia voor in vitro experimenten en zijn een belangrijk hulpmiddel om microgliale canonieke functies, waaronder fagocytose, te onderzoeken. Microglia zijn de professionele fagocyten van de hersenen en het CZS, waar ze celresten, geaggregeerde eiwitten en afgebroken myelineopruimen 14. Microglia functioneren ook bij synaptische remodellering door synapsen te overspoelen en in de verdediging tegen externe infecties door fagocytose van pathogenen 15,16. In dit protocol wordt fagocytose door iMG’s beoordeeld met behulp van menselijke synaptosomen als materiaal voor iMG-overspoeling. Hiertoe wordt een beschrijving beschreven voor het isoleren van synaptosomen afgeleid van humane i3 LMN’s. De i3LMN-afgeleide humane synaptosomen zijn gelabeld met een pH-gevoelige kleurstof die kwantificering mogelijk maakt van synaptosomen gelokaliseerd in zure compartimenten tijdens fagosoomverwerking en afbraak in vitro. Een fagocytosetest met behulp van live-cell microscopie wordt getoond voor het monitoren van het dynamische proces van microglia-engulfment in realtime. Deze functionele test legt een basis om mogelijke defecten in microgliale fagocytose in gezondheid en ziekte te onderzoeken met behulp van een compleet menselijk systeem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier beschreven differentiatieprotocol biedt een efficiënte methode om iPSC-afgeleide microglia-achtige cellen te verkrijgen in ~ 6-8 weken met een hoge zuiverheid en in een voldoende opbrengst om immunofluorescentie-experimenten en andere testen uit te voeren die een groter aantal cellen vereisen. Dit protocol heeft in 1 week tot 1 × 106 iMG’s opgeleverd, wat eiwit- en RNA-extractie en bijbehorende downstream-analyses mogelijk maakt (bijv. RNASeq, qRT-PCR, western blot, massaspectrometrie). Dat gezegd h…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Michael Ward voor het leveren van de WTC11 hNIL iPSC-lijn voor motorneurondifferentiatie en de Jackson Laboratories voor het leveren van de KOLF2.1J WT-kloon B03 iPSC-lijn die wordt gebruikt voor microgliadifferentiatie. We bedanken ook Dorothy Schafer voor haar steun tijdens de implementatie van de protocollen, Anthony Giampetruzzi en John Landers voor hun hulp bij het live-cell imaging systeem, evenals Hayden Gadd voor zijn technische bijdragen tijdens revisies en Jonathan Jung voor zijn medewerking aan deze studie. Dit werk werd ondersteund door het Dan and Diane Riccio Fund for Neuroscience van UMASS Chan Medical School en het Angel Fund, Inc.
Materials
| Antibodies for immunofluorescence analysis | |||
| anti-IBA1 rabbit antibody | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 dilution |
| anti-P2RY12 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 dilution |
| anti-TMEM119 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 dilution |
| Antibodies for Western blot analysis | |||
| anti-β-Tubulin rabbit antibody | Abcam | ab6046 | 1:500 dilution |
| anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody | Abclonal | A6344 | 1:1,000 dilution |
| anti-PSD95 mouse antibody | Millipore | MAB1596 | 1:500 dilution |
| Borate buffer components | |||
| Boric acid (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium chloride (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Sodium tetraborate (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Cell culture materials | |||
| 6-well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm Cell Strainers | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated | CELLTREAT | 229620 | |
| Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile | CELLTREAT | 229305 | |
| low adherence round-bottom 96-well plate | Corning | 7007 | |
| Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353847, | |
| Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
| Cell dissociation reagents | |||
| Accutase | Corning | 25058CI | dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation |
| TrypLE reagent | Life Technologies | 12-605-010 | dissociation reagents used for microglia differentiation |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Coating reagents for cell culture | |||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning™ | 354230 | Referred as to extracellular matrix coating reagent |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Referred as to laminin 521 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer |
| Components of iPSC media | |||
| mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | To prepare iPSC media mixed the components to 1x |
| Components of EB media | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | final concentration 50 ng/mL |
| iPSC media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | final concentration 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | final concentration 50 ng/mL |
| Components of PMP base media | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | final concentration 1x |
| Components of PMP complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | final concentration 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 100 ng/mL |
| PMP base media | final concentration 1x | ||
| Components of iMG base media | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| Components of iMG complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-34 | PeproTech or Biologend | 200-34 or 577904 | final concentration 100 ng/mL |
| iMG base media | final concentration 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | final concentration 50 ng/mL |
| Components of Induction base media | |||
| DMEM/F12 with HEPES | Gibco | 11330032 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| Components of Complete induction media | |||
| Compound E | Calbiochem | 565790 | final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS |
| Induction base media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 μM |
| Components of Neuron media | |||
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | final concentration 1x for media and suplemment |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| iPSC lines used in this study | |||
| KOLF2.1J: WT clone B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Synaptosome isolation reagents | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 87793 | Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes |
| Phagocytosis assay dyes | |||
| NucBlue Live Ready reagent | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Red, succinimidyl ester | ThermoFisher Scientific | P36600 | Referred as to pH-sensitive dye |
| Other cell-culture reagents | |||
| Trypan Blue, 0.4% Solution | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Reconstitute to 40 mM in sterile water |
| Cytochalasin D | Sigma | final concentration 10 µM | |
| DPBS with Calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | Referred as to DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017015 | Referred as to laminin |
| Software and Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytation 5 live cell imaging reader | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | version 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | refer as tube shaker | |
| Water sonicator | Elma | Mode Transsonic 310 |
Referências
- Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254 (2021).
- Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065 (2021).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
- Brownjohn, P. W., et al. Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia. Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).
- Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
- McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
- Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
- Haenseler, W., Rajendran, L. Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia. Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).
- Wilgenburg, B. v., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PloS One. 8 (8), 71098 (2013).
- Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of tissue-resident macrophages. Frontiers in Immunology. 6, 486 (2015).
- Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson’s disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144 (2018).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545 (2015).
- Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138 (2014).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
- Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808 (2020).
- Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
- Schmidt, E. J., et al. ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
