الفصل التلقائي وجمع المواد المرتبطة بالسرطان من العينات السريرية
Summary
تصف هذه الورقة تطبيق المعدات الآلية لفصل وجمع المواد بسهولة وكفاءة ، مثل الحمض النووي الخالي من الخلايا والخلايا السرطانية المنتشرة ، من الدم الكامل.
Abstract
في الآونة الأخيرة ، تم استخدام الخزعات السائلة لتشخيص الأمراض المختلفة ، بما في ذلك السرطان. تحتوي سوائل الجسم على العديد من المواد ، بما في ذلك الخلايا والبروتينات والأحماض النووية الناشئة من الأنسجة الطبيعية ، ولكن بعض هذه المواد تنشأ أيضا من المنطقة المريضة. يلعب فحص وتحليل هذه المواد في سوائل الجسم دورا محوريا في تشخيص الأمراض المختلفة. لذلك ، من المهم فصل المواد المطلوبة بدقة ، ويتم تطوير العديد من التقنيات لاستخدامها لهذا الغرض.
لقد قمنا بتطوير نوع مختبر على قرص من الأجهزة والنظام الأساسي المسمى CD-PRIME. هذا الجهاز آلي وله نتائج جيدة لتلوث العينات واستقرار العينة. علاوة على ذلك ، فهي تتمتع بمزايا عائد الاستحواذ الجيد ، ووقت التشغيل القصير ، وقابلية التكاثر العالية. بالإضافة إلى ذلك ، اعتمادا على نوع القرص المراد تركيبه ، يمكن فصل البلازما التي تحتوي على الحمض النووي الخالي من الخلايا أو الخلايا السرطانية المنتشرة أو خلايا الدم الطرفية أحادية النواة أو المعاطف المفرغة. وبالتالي ، يمكن الحصول على مجموعة متنوعة من المواد الموجودة في سوائل الجسم لمجموعة متنوعة من التطبيقات النهائية ، بما في ذلك دراسة omics.
Introduction
يعد الكشف المبكر والدقيق عن الأمراض المختلفة ، بما في ذلك السرطان ، أهم عامل في وضع استراتيجية العلاج1،2،3،4. على وجه الخصوص ، يرتبط الكشف المبكر عن السرطان ارتباطا وثيقا بزيادة فرص البقاء على قيد الحياة للمريض5،6،7،8. في الآونة الأخيرة ، كانت الخزعات السائلة في دائرة الضوء للكشف المبكر عن السرطان. تخضع الأورام الصلبة لتكوين الأوعية الدموية وتطلق مواد مختلفة في الدم. على وجه الخصوص ، تم العثور على الحمض النووي المتداول (ctDNAs) ، والحمض النووي الريبي المتداول (ctRNAs) ، والبروتينات ، والحويصلات مثل exosomes ، والخلايا السرطانية المنتشرة (CTCs) في دم مرضى السرطان 2,9. على الرغم من وجود اختلافات في كمية هذه المواد ، إلا أنها تلاحظ باستمرار ليس فقط في المراحل المبكرة ولكن أيضا في المراحل اللاحقة 6,10. ومع ذلك ، فإن هذه الفروق الفردية عالية جدا. على سبيل المثال ، كمية الحمض النووي الخالي من الخلايا (cfDNA) التي تحتوي على ctDNA أقل من 1,000 نانوغرام ، وعدد CTCs أقل من 100 في 10 مل من الدم الكامل من مرضى السرطان11،12،13. وصفت العديد من الدراسات السرطان باستخدام هذه المواد الموجودة بكميات أقل (أي cfDNA و ctDNA و CTCs). للحصول على نتائج دقيقة ، من المهم فصل كميات صغيرة من المواد بدقة عالية النقاء13,14. تستخدم طرق الطرد المركزي التقليدية بشكل شائع ، ولكن يصعب التعامل معها ولها نقاء منخفض اعتمادا على مهارة المستخدم. منذ اكتشاف CTCs ، تم تطوير العديد من تقنيات الفصل ، مثل الطرد المركزي أو فصل درجة الكثافة ، والمناعة ، وطرق الموائع الدقيقة. تم تطوير العديد من تقنيات الاحتواء منذ اكتشاف CTCs. ومع ذلك ، غالبا ما تكون هذه التقنيات محدودة عندما يكون من الضروري عزل الخلايا عن الرقائق والأغشية المختلفة المستخدمة لعزلها15. أيضا ، تتطلب طرق وضع العلامات معدات مثل FACS ، وهناك حدود لعملية المصب بسبب تلوث العلامات.
في الآونة الأخيرة ، زاد استخدام الخزعات السائلة ، وتجري دراسات مختلفة للكشف المبكر عن السرطان. على الرغم من أن هذه الطريقة بسيطة ، إلا أنه لا تزال هناك صعوبات في التحليل النهائي ، وتحاول دراسات مختلفة التغلب على هذه الصعوبات16,17. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب العديد من المواقع ، بما في ذلك المستشفيات ، طرقا آلية وقابلة للتكرار وعالية النقاء ملائمة للاستخدام. هنا ، قمنا بتطوير مختبر على قرص للفصل الآلي للمواد من عينات الدم بعد خزعة سائلة. تعتمد هذه الأجهزة على مبدأ الطرد المركزي ، الموائع الدقيقة ، والتقاط الخلايا بحجم المسام. هناك ثلاثة أنواع من الأقراص: يمكن ل LBx-1 الحصول على البلازما ومعطف بافي ، بينما يمكن ل LBx-2 الحصول على البلازما و PBMC من الدم الكامل بحجم أقل من 10 مل ؛ يمكن ل FAST-auto أيضا الحصول على CTCs باستخدام غشاء قابل للإزالة من القرص. يمكن استخدام ما يصل إلى أربعة من كل قرص في تشغيل واحد. قبل كل شيء ، تتمثل ميزة هذا الجهاز والطريقة في أنه يمكنه الحصول على مجموعة متنوعة من المواد المشتقة من السرطان من نفس العينة باستخدام كمية صغيرة من الدم. هذا يعني أن دم المريض يحتاج إلى سحب مرة واحدة فقط. بالإضافة إلى ذلك ، لديها ميزة استبعاد الأخطاء بسبب الاختلافات في فترة أخذ عينات الدم. هذه المنصة سهلة الاستخدام وتوفر نتائج دقيقة للخزعات السائلة والتطبيقات النهائية. في هذا البروتوكول ، يتم تقديم استخدام الجهاز والخرطوشة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعتمد كمية وتركيز cfDNA و CTC على الفرد والمرحلة ونوع السرطان. كما يعتمد على حالة المريض2،4،5،10،20. على وجه الخصوص ، في المراحل المبكرة أو السرطانية ، تكون تركيزات المواد المرتبطة بالسرطان منخفضة للغاية ، ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه المخطوطة جزئيا من قبل الصندوق الكوري لتطوير الأجهزة الطبية (KMDF، المنحة رقم. RS-2020-KD000019) والمعهد الكوري لتطوير الصناعة الصحية (KHIDI، رقم المنحة. HI19C0521020020).
Materials
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 15 mL Conical Tube | SPL | 50015 | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633) |
| Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 preps version |
| BD Vacutainer blood collection tubes | BD | 367525 | EDTA Blood Collection Tube (10 mL) |
| BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment | |
| CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
| FAST Auto cartridge | Clinomics | CLX-M3001 | |
| LBx-1 cartridge | Clinomics | CLX-M4101 | |
| LBx-2 cartridge | Clinomics | CLX-M4201 | |
| OPR-2000 instrument | Clinomics | CLX-I2001 | |
| Cover Glass | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
| DynaMag 2 Magnet Stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Ficoll Paque Solution | GE healthcare | 17-1440-03 | density gradient solution |
| Filter Tip, 10 µL | Axygen | AX-TF-10 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 200 µL | Axygen | AX-TF-200 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 100 µL | Axygen | AX-TF-100 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 1000 µL | Axygen | AX-TF-1000 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 324204 | |
| FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin | BD Biosciences | 347653 | |
| Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O) | Sigma Aldrich | 433284 | |
| Kimtech Science Wipers | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
| Latex glove | Microflex | 63-754 | |
| Magnetic Bead Separation Rack | V&P Scientific | VP 772F2M-2 | |
| Manual Pipetting (0.5-10 µL) | Eppendorf | 3120000020 | |
| Manual Pipetting (2-20 µL) | Eppendorf | 3120000038 | |
| Manual Pipetting (10-100 µL) | Eppendorf | 3120000046 | |
| Manual Pipetting (20-200 µL) | Eppendorf | 3120000054 | |
| Manual Pipetting (100-1000 µL) | Eppendorf | 3120000062 | |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
| Normal Human IgG Control | R&D Systems | 1-001-A | |
| OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
| Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) | Corning | 21-040CVC | |
| Portable Pipet Aid | Drummond | 4-000-201 | |
| Slide Glass | Marienfeld Superior | HSU-1000612 | |
| StainTray Staining box | Simport | M920 | |
| Sterile Serological Pipette (10 mL) | SPL | 91010 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | 93443 | |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Whole Blood | Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary. | ||
| X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator) | Excelitas | 010-00157 |
Referências
- Babayan, A., Pantel, K. Advances in liquid biopsy approaches for early detection and monitoring of cancer. Genome Medicine. 10 (1), 21 (2018).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).
- Bardelli, A., Pantel, K. Liquid biopsies, what we do not know (yet). Cancer Cell. 31 (2), 172-179 (2017).
- Mattox, A. K., et al. Applications of liquid biopsies for cancer. Science Translational Medicine. 11 (507), (2019).
- Heitzer, E., Perakis, S., Geigl, J. B., Speicher, M. R. The potential of liquid biopsies for the early detection of cancer. NPJ Precision Oncology. 1 (1), 36 (2017).
- Scudellari, M. Myths that will not die. Nature. 582 (7582), 322-326 (2015).
- Prasad, V., Fojo, T., Brada, M. Precision oncology: origins, optimism, and potential. The Lancet Oncology. 17 (2), 81-86 (2016).
- Prasad, V. Perspective: The precision-oncology illusion. Nature. 537 (7619), 63 (2016).
- Siravegna, G., Marsoni, S., Siena, S., Bardelli, A. Integrating liquid biopsies into the management of cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (9), 531-548 (2017).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Udomruk, S., Orrapin, S., Pruksakorn, D., Chaiyawat, P. Size distribution of cell-free DNA in oncology. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 166, 103455 (2021).
- Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and future directions. Cancer Letters. 253 (2), 180-204 (2007).
- Loeian, M. S., et al. Liquid biopsy using the nanotube-CTC-chip: capture of invasive CTCs with high purity using preferential adherence in breast cancer patients. Lab on a Chip. 19 (11), 1899-1915 (2019).
- Rikkert, L. G., Van Der Pol, E., Van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R., Coumans, F. A. W. Centrifugation affects the purity of liquid biopsy-based tumor biomarkers. Cytometry Part A. 93 (12), 1207-1212 (2018).
- Sharma, S., et al. Circulating tumor cell isolation, culture, and downstream molecular analysis. Biotechnology advances. 36 (4), 1063-1078 (2018).
- Bennett, C. W., Berchem, G., Kim, Y. J., El-Khoury, V. Cell-free DNA and next-generation sequencing in the service of personalized medicine for lung cancer. Oncotarget. 7 (43), 71013 (2016).
- Lowes, L. E., et al. Circulating tumor cells (CTC) and cell-free DNA (cfDNA) workshop 2016: scientific opportunities and logistics for cancer clinical trial incorporation. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1505 (2016).
- Bryzgunova, O. E., Konoshenko, M. Y., Laktionov, P. P. Concentration of cell-free DNA in different tumor types. Expert Review of Molecular Diagnostics. 21 (1), 63-75 (2021).
- Park, Y., et al. Circulating tumour cells as an indicator of early and systemic recurrence after surgical resection in pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. 11 (1), 1-12 (2021).
- Heidrich, I., Ačkar, L., Mossahebi Mohammadi, P., Pantel, K. Liquid biopsies: Potential and challenges. International Journal of Cancer. 148 (3), 528-545 (2021).
- Celec, P., Vlková, B., Lauková, L., Bábíčková, J., Boor, P. Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, 1 (2018).
- Thierry, A. R., et al. Origin and quantification of circulating DNA in mice with human colorectal cancer xenografts. Nucleic Acids Research. 38 (18), 6159-6175 (2010).
- Moreira, V. G., de la Cera Martínez, T., Gonzalez, E. G., Garcia, B. P., Menendez, F. V. A. Increase in and clearance of cell-free plasma DNA in hemodialysis quantified by real-time PCR. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 44 (12), 1410-1415 (2006).
- Gauthier, V. J., Tyler, L. N., Mannik, M. Blood clearance kinetics and liver uptake of mononucleosomes in mice. Journal of Immunology. 156 (3), 1151-1156 (1996).
- Meng, S., et al. Circulating tumor cells in patients with breast cancer dormancy. Clinical Cancer Research. 10 (24), 8152-8162 (2004).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nature Reviews Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
- Zhou, J., et al. Isolation of circulating tumor cells in non-small-cell-lung-cancer patients using a multi-flow microfluidic channel. Microsystems & Nanoengineering. 5 (1), 8 (2019).
- Sajay, B. N. G., et al. Towards an optimal and unbiased approach for tumor cell isolation. Biomedical Microdevices. 15 (4), 699-709 (2013).
- Bailey, P. C., Martin, S. S. Insights on CTC biology and clinical impact emerging from advances in capture technology. Cells. 8 (6), 553 (2019).
- Ahn, S. M., Simpson, R. J. Body fluid proteomics: Prospects for biomarker discovery. Proteomics-Clinical Applications. 1 (9), 1004-1015 (2007).
