臨床検体からのがん関連物質の自動分離・回収
Summary
本稿では、全血から無細胞DNAや循環腫瘍細胞などの物質を簡便かつ効率的に分離・回収するための自動化装置の適用について述べる。
Abstract
最近、リキッドバイオプシーは癌を含む様々な疾患の診断に使用されている。体液には、正常組織に由来する細胞、タンパク質、核酸など、多くの物質が含まれていますが、これらの物質の中には患部に由来するものもあります。体液中のこれらの物質の調査と分析は、さまざまな病気の診断において極めて重要な役割を果たします。したがって、必要な物質を正確に分離することが重要であり、この目的に使用するためにいくつかの技術が開発されています。
私たちは、CD-PRIMEという名前のディスク上のラボタイプのデバイスとプラットフォームを開発しました。この装置は自動化されており、サンプルの汚染とサンプルの安定性に良好な結果が得られます。また、取得収率が良く、操作時間が短く、再現性が高いという利点があります。さらに、装着する椎間板の種類に応じて、無細胞DNAを含む血漿、循環腫瘍細胞、末梢血単核球、またはバフィーコートを分離することができます。したがって、体液中に存在する様々な材料の取得は、オミクスの研究を含む様々な下流用途のために行うことができる。
Introduction
がんを含む様々な疾患を早期かつ正確に発見することは、治療戦略を確立する上で最も重要な要素です1,2,3,4。特に、癌の早期発見は、患者の生存率の増加と密接に関連している5、6、7、8。近年、がんの早期発見のためにリキッドバイオプシーが脚光を浴びています。固形腫瘍は血管新生を受け、さまざまな物質を血中に放出します。特に、循環DNA(ctDNA)、循環RNA(ctRNA)、タンパク質、エクソソームなどの小胞、および循環腫瘍細胞(CTC)が癌患者の血液中に見出されている2,9。これらの物質の量には違いがありますが、初期段階だけでなく後期段階でも一貫して観察されます6,10。ただし、これらの個人差は非常に高いです。例えば、ctDNAを含む無細胞DNA(cfDNA)の量は1,000ng未満であり、CTCの数は癌患者11,12,13の全血10mLで100未満である。多くの研究は、より少ない量で存在するこれらの物質(すなわち、cfDNA、ctDNA、およびCTC)を使用して癌を特徴付けています。正確な結果を得るためには、少量の物質を高純度で正確に分離することが重要です13,14。従来の遠心分離法が一般的であるが、取り扱いが難しく、ユーザーの熟練度によっては純度が低い。CTCの発見以来、遠心分離や密度グレード分離、イムノビーズ、マイクロ流体法など、いくつかの分離技術が開発されてきました。CTCの発見以来、いくつかの封じ込め技術が開発されてきました。しかしながら、これらの技術は、それらを単離するために使用される様々なチップおよび膜から細胞を単離する必要がある場合にしばしば制限される15。また、タグ付け方法はFACSなどの設備を必要とし、タグ付け汚染による下流工程に限界があります。
近年、リキッドバイオプシーの利用が増加しており、がんの早期発見に向けて様々な研究が行われています。この方法は単純ですが、ダウンストリーム分析にはまだ困難があり、さまざまな研究がこれらの困難を克服しようとしています16,17。さらに、病院を含む多くの施設では、使いやすく、自動化された再現性のある高純度の方法が必要です。ここでは、リキッドバイオプシー後の血液サンプルからの物質の自動分離のためのラボオンディスクを開発しました。これらのデバイスは、遠心分離、マイクロフルイディクス、およびポアサイズの細胞捕捉の原理に基づいています。ディスクには3つのタイプがあります:LBx-1は血漿とバフィーコートを獲得でき、LBx-2は10mL未満の容量の全血から血漿とPBMCを取得できます。FAST-autoは、ディスクから取り外し可能なメンブレンを使用してCTCを取得することもできます。1回の実行で最大4枚のディスクを使用できます。とりわけ、この装置及び方法の利点は、少量の血液を用いて、同一の試料から様々な癌由来物質を得ることができることである。これは、患者の血液を一度だけ採取する必要があることを意味します。また、採血期間の違いによる誤差を排除できるという利点もある。このプラットフォームは使いやすく、リキッドバイオプシーやダウンストリームアプリケーションに正確な結果を提供します。このプロトコルでは、デバイスとカートリッジの使用法が導入されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
cfDNAとCTCの量と濃度は、がんの個人、病期、および種類によって異なります。また、患者2、4、5、10、20の状態にも依存します。特にがんの早期・前がん期では、がん関連物質の濃度が非常に低いため、検出できない可能性が高いです。それにもかかわらず、早期発見は?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この原稿の一部は、韓国医療機器開発基金(KMDF、助成金番号。 RS-2020-KD000019)および韓国保健産業開発研究院(KHIDI、助成金番号。 HI19C0521020020)。
Materials
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 15 mL Conical Tube | SPL | 50015 | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633) |
| Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 preps version |
| BD Vacutainer blood collection tubes | BD | 367525 | EDTA Blood Collection Tube (10 mL) |
| BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment | |
| CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
| FAST Auto cartridge | Clinomics | CLX-M3001 | |
| LBx-1 cartridge | Clinomics | CLX-M4101 | |
| LBx-2 cartridge | Clinomics | CLX-M4201 | |
| OPR-2000 instrument | Clinomics | CLX-I2001 | |
| Cover Glass | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
| DynaMag 2 Magnet Stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Ficoll Paque Solution | GE healthcare | 17-1440-03 | density gradient solution |
| Filter Tip, 10 µL | Axygen | AX-TF-10 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 200 µL | Axygen | AX-TF-200 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 100 µL | Axygen | AX-TF-100 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 1000 µL | Axygen | AX-TF-1000 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 324204 | |
| FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin | BD Biosciences | 347653 | |
| Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O) | Sigma Aldrich | 433284 | |
| Kimtech Science Wipers | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
| Latex glove | Microflex | 63-754 | |
| Magnetic Bead Separation Rack | V&P Scientific | VP 772F2M-2 | |
| Manual Pipetting (0.5-10 µL) | Eppendorf | 3120000020 | |
| Manual Pipetting (2-20 µL) | Eppendorf | 3120000038 | |
| Manual Pipetting (10-100 µL) | Eppendorf | 3120000046 | |
| Manual Pipetting (20-200 µL) | Eppendorf | 3120000054 | |
| Manual Pipetting (100-1000 µL) | Eppendorf | 3120000062 | |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
| Normal Human IgG Control | R&D Systems | 1-001-A | |
| OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
| Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) | Corning | 21-040CVC | |
| Portable Pipet Aid | Drummond | 4-000-201 | |
| Slide Glass | Marienfeld Superior | HSU-1000612 | |
| StainTray Staining box | Simport | M920 | |
| Sterile Serological Pipette (10 mL) | SPL | 91010 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | 93443 | |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Whole Blood | Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary. | ||
| X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator) | Excelitas | 010-00157 |
Referências
- Babayan, A., Pantel, K. Advances in liquid biopsy approaches for early detection and monitoring of cancer. Genome Medicine. 10 (1), 21 (2018).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).
- Bardelli, A., Pantel, K. Liquid biopsies, what we do not know (yet). Cancer Cell. 31 (2), 172-179 (2017).
- Mattox, A. K., et al. Applications of liquid biopsies for cancer. Science Translational Medicine. 11 (507), (2019).
- Heitzer, E., Perakis, S., Geigl, J. B., Speicher, M. R. The potential of liquid biopsies for the early detection of cancer. NPJ Precision Oncology. 1 (1), 36 (2017).
- Scudellari, M. Myths that will not die. Nature. 582 (7582), 322-326 (2015).
- Prasad, V., Fojo, T., Brada, M. Precision oncology: origins, optimism, and potential. The Lancet Oncology. 17 (2), 81-86 (2016).
- Prasad, V. Perspective: The precision-oncology illusion. Nature. 537 (7619), 63 (2016).
- Siravegna, G., Marsoni, S., Siena, S., Bardelli, A. Integrating liquid biopsies into the management of cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (9), 531-548 (2017).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Udomruk, S., Orrapin, S., Pruksakorn, D., Chaiyawat, P. Size distribution of cell-free DNA in oncology. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 166, 103455 (2021).
- Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and future directions. Cancer Letters. 253 (2), 180-204 (2007).
- Loeian, M. S., et al. Liquid biopsy using the nanotube-CTC-chip: capture of invasive CTCs with high purity using preferential adherence in breast cancer patients. Lab on a Chip. 19 (11), 1899-1915 (2019).
- Rikkert, L. G., Van Der Pol, E., Van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R., Coumans, F. A. W. Centrifugation affects the purity of liquid biopsy-based tumor biomarkers. Cytometry Part A. 93 (12), 1207-1212 (2018).
- Sharma, S., et al. Circulating tumor cell isolation, culture, and downstream molecular analysis. Biotechnology advances. 36 (4), 1063-1078 (2018).
- Bennett, C. W., Berchem, G., Kim, Y. J., El-Khoury, V. Cell-free DNA and next-generation sequencing in the service of personalized medicine for lung cancer. Oncotarget. 7 (43), 71013 (2016).
- Lowes, L. E., et al. Circulating tumor cells (CTC) and cell-free DNA (cfDNA) workshop 2016: scientific opportunities and logistics for cancer clinical trial incorporation. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1505 (2016).
- Bryzgunova, O. E., Konoshenko, M. Y., Laktionov, P. P. Concentration of cell-free DNA in different tumor types. Expert Review of Molecular Diagnostics. 21 (1), 63-75 (2021).
- Park, Y., et al. Circulating tumour cells as an indicator of early and systemic recurrence after surgical resection in pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. 11 (1), 1-12 (2021).
- Heidrich, I., Ačkar, L., Mossahebi Mohammadi, P., Pantel, K. Liquid biopsies: Potential and challenges. International Journal of Cancer. 148 (3), 528-545 (2021).
- Celec, P., Vlková, B., Lauková, L., Bábíčková, J., Boor, P. Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, 1 (2018).
- Thierry, A. R., et al. Origin and quantification of circulating DNA in mice with human colorectal cancer xenografts. Nucleic Acids Research. 38 (18), 6159-6175 (2010).
- Moreira, V. G., de la Cera Martínez, T., Gonzalez, E. G., Garcia, B. P., Menendez, F. V. A. Increase in and clearance of cell-free plasma DNA in hemodialysis quantified by real-time PCR. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 44 (12), 1410-1415 (2006).
- Gauthier, V. J., Tyler, L. N., Mannik, M. Blood clearance kinetics and liver uptake of mononucleosomes in mice. Journal of Immunology. 156 (3), 1151-1156 (1996).
- Meng, S., et al. Circulating tumor cells in patients with breast cancer dormancy. Clinical Cancer Research. 10 (24), 8152-8162 (2004).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nature Reviews Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
- Zhou, J., et al. Isolation of circulating tumor cells in non-small-cell-lung-cancer patients using a multi-flow microfluidic channel. Microsystems & Nanoengineering. 5 (1), 8 (2019).
- Sajay, B. N. G., et al. Towards an optimal and unbiased approach for tumor cell isolation. Biomedical Microdevices. 15 (4), 699-709 (2013).
- Bailey, P. C., Martin, S. S. Insights on CTC biology and clinical impact emerging from advances in capture technology. Cells. 8 (6), 553 (2019).
- Ahn, S. M., Simpson, R. J. Body fluid proteomics: Prospects for biomarker discovery. Proteomics-Clinical Applications. 1 (9), 1004-1015 (2007).
