Separación y recolección automáticas de sustancias relacionadas con el cáncer a partir de muestras clínicas
Summary
Este documento describe la aplicación de equipos automatizados para separar y recolectar sustancias de manera fácil y eficiente, como ADN libre de células y células tumorales circulantes, de sangre total.
Abstract
Recientemente, las biopsias líquidas se han utilizado para diagnosticar diversas enfermedades, incluido el cáncer. Los fluidos corporales contienen muchas sustancias, incluyendo células, proteínas y ácidos nucleicos que se originan en los tejidos normales, pero algunas de estas sustancias también se originan en el área enferma. La investigación y el análisis de estas sustancias en los fluidos corporales juegan un papel fundamental en el diagnóstico de diversas enfermedades. Por lo tanto, es importante separar con precisión las sustancias requeridas, y se desarrollan varias técnicas para ser utilizadas para este propósito.
Hemos desarrollado un tipo de dispositivo y plataforma de laboratorio en un disco llamado CD-PRIME. Este dispositivo está automatizado y tiene buenos resultados para la contaminación de la muestra y la estabilidad de la muestra. Además, tiene ventajas de un buen rendimiento de adquisición, un corto tiempo de operación y una alta reproducibilidad. Además, dependiendo del tipo de disco a montar, se puede separar el plasma que contiene ADN libre de células, las células tumorales circulantes, las células mononucleares de sangre periférica o las capas leucocitarias. Por lo tanto, la adquisición de una variedad de materiales presentes en los fluidos corporales se puede hacer para una variedad de aplicaciones posteriores, incluido el estudio de ómicas.
Introduction
La detección precoz y precisa de diversas enfermedades, incluyendo el cáncer, es el factor más importante para establecer una estrategia de tratamiento 1,2,3,4. En particular, la detección precoz del cáncer está estrechamente relacionada con el aumento de las posibilidades de supervivencia para el paciente 5,6,7,8. Recientemente, las biopsias líquidas han estado en el centro de atención para la detección temprana del cáncer. Los tumores sólidos sufren angiogénesis y liberan diversas sustancias en la sangre. En particular, se han encontrado ADN circulantes (ctDNAs), ARN circulantes (ctRNAs), proteínas, vesículas como exosomas y células tumorales circulantes (CTCs) en la sangre de pacientes con cáncer 2,9. Aunque existen diferencias en la cantidad de estas sustancias, se observan consistentemente no sólo en las primeras etapas, sino también en las etapas posteriores 6,10. Sin embargo, estas diferencias individuales son muy altas; por ejemplo, la cantidad de ADN libre de células (ADNcf) que contiene ctDNA es inferior a 1.000 ng, y el número de CTC es inferior a 100 en 10 ml de sangre total de pacientes con cáncer11,12,13. Muchos estudios han caracterizado el cáncer utilizando estas sustancias presentes en cantidades menores (es decir, cfDNA, ctDNA y CTC). Para obtener resultados precisos, es importante separar con precisión pequeñas cantidades de sustancias con alta pureza13,14. Los métodos convencionales de centrifugación se utilizan comúnmente, pero son difíciles de manejar y tienen baja pureza dependiendo de la habilidad del usuario. Desde el descubrimiento de las CTC, se han desarrollado varias técnicas de separación, como la centrifugación o separación de grado de densidad, la inmunoperla y los métodos microfluídicos. Se han desarrollado varias técnicas de contención desde el descubrimiento de los CTC. Sin embargo, estas técnicas a menudo son limitadas cuando es necesario aislar las células de los diversos chips y membranas utilizadas para aislarlas15. Además, los métodos de etiquetado requieren equipos como FACS, y existen límites para el proceso posterior debido a la contaminación del etiquetado.
Recientemente, el uso de biopsias líquidas ha aumentado, y se están realizando diversos estudios para la detección temprana del cáncer. A pesar de que este método es simple, todavía existen dificultades en el análisis posterior, y varios estudios están tratando de superar esas dificultades16,17. Además, muchos sitios, incluidos los hospitales, requieren métodos automatizados, reproducibles y de alta pureza que sean cómodos de usar. Aquí, hemos desarrollado un laboratorio en un disco para la separación automatizada de sustancias de muestras de sangre después de una biopsia líquida. Estos dispositivos se basan en el principio de centrifugación, microfluídica y captura de células del tamaño de un poro. Hay tres tipos de discos: LBx-1 puede adquirir plasma y capa leucocitaria, mientras que LBx-2 puede adquirir plasma y PBMC de sangre total con un volumen de menos de 10 ml; FAST-auto también puede adquirir CTC utilizando una membrana que se puede quitar del disco. Se pueden usar hasta cuatro de cada disco en una sola ejecución. Sobre todo, la ventaja de este dispositivo y método es que puede obtener una variedad de sustancias derivadas del cáncer de la misma muestra utilizando una pequeña cantidad de sangre. Esto significa que la sangre del paciente solo necesita ser extraída una vez. Además, tiene la ventaja de excluir errores debidos a diferencias en el período de muestreo de sangre. Esta plataforma es fácil de usar y proporciona resultados precisos para biopsias líquidas y aplicaciones posteriores. En este protocolo, se introduce el uso del dispositivo y el cartucho.
Protocol
Representative Results
Discussion
La cantidad y concentración de cfDNA y CTC depende del individuo, la etapa y el tipo de cáncer. También depende de la condición del paciente 2,4,5,10,20. En particular, en las etapas tempranas o precancerosas del cáncer, las concentraciones de sustancias relacionadas con el cáncer son muy bajas, por lo que existe una alta posibilidad de que no se pueda d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este manuscrito fue apoyado en parte por el Fondo de Desarrollo de Dispositivos Médicos de Corea (KMDF, Subvención No. RS-2020-KD000019) y el Instituto de Desarrollo de la Industria de la Salud de Corea (KHIDI, Subvención No. HI19C0521020020).
Materials
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 15 mL Conical Tube | SPL | 50015 | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633) |
| Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 preps version |
| BD Vacutainer blood collection tubes | BD | 367525 | EDTA Blood Collection Tube (10 mL) |
| BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment | |
| CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
| FAST Auto cartridge | Clinomics | CLX-M3001 | |
| LBx-1 cartridge | Clinomics | CLX-M4101 | |
| LBx-2 cartridge | Clinomics | CLX-M4201 | |
| OPR-2000 instrument | Clinomics | CLX-I2001 | |
| Cover Glass | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
| DynaMag 2 Magnet Stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Ficoll Paque Solution | GE healthcare | 17-1440-03 | density gradient solution |
| Filter Tip, 10 µL | Axygen | AX-TF-10 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 200 µL | Axygen | AX-TF-200 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 100 µL | Axygen | AX-TF-100 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 1000 µL | Axygen | AX-TF-1000 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 324204 | |
| FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin | BD Biosciences | 347653 | |
| Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O) | Sigma Aldrich | 433284 | |
| Kimtech Science Wipers | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
| Latex glove | Microflex | 63-754 | |
| Magnetic Bead Separation Rack | V&P Scientific | VP 772F2M-2 | |
| Manual Pipetting (0.5-10 µL) | Eppendorf | 3120000020 | |
| Manual Pipetting (2-20 µL) | Eppendorf | 3120000038 | |
| Manual Pipetting (10-100 µL) | Eppendorf | 3120000046 | |
| Manual Pipetting (20-200 µL) | Eppendorf | 3120000054 | |
| Manual Pipetting (100-1000 µL) | Eppendorf | 3120000062 | |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
| Normal Human IgG Control | R&D Systems | 1-001-A | |
| OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
| Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) | Corning | 21-040CVC | |
| Portable Pipet Aid | Drummond | 4-000-201 | |
| Slide Glass | Marienfeld Superior | HSU-1000612 | |
| StainTray Staining box | Simport | M920 | |
| Sterile Serological Pipette (10 mL) | SPL | 91010 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | 93443 | |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Whole Blood | Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary. | ||
| X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator) | Excelitas | 010-00157 |
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