Method Article

Entrar em contato com a Hipersensibilidade como modelo murino de dermatite de contato alérgico

DOI:

10.3791/64329

⸱

September 26th, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 2Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

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Erratum Notice

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis
Posted by JoVE Editors on 1/19/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. The Protocol and Representative Results sections were updated.

Step 3.2.1 of the Protocol has been updated from:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone-ethanol mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

to:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone: olive oil mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

Figure 1 of the Representative Results has been updated from:

Mouse ear thickness measurement experiment diagram; TNCB-induced dermatitis comparison.
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mice sensitization process; diagram of control/test groups, TNCB application, ear thickness measurement.
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2 of the Representative Results has been updated from:

CHS induction in mice using TNCB, diagram showing sensitization, i.v. cell transfer, ear measurement.
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mouse sensitization and TNCB application diagram; CHS study setup with control and test groups.
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Summary

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A hipersensibilidade de contato (CHS) é um modelo experimental de murina de dermatite de contato alérgico (ACD). O CHS baseia-se na sensibilização com hapten reativo pintando a pele raspada do peito e abdômen, com um subsequente desafio da pele do ouvido com um hapten diluído, causando uma reação de inchaço que é avaliada de várias maneiras.

Abstract

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A hipersensibilidade de contato (CHS) é um modelo experimental de dermatite de contato alérgico (ACD) que pode ser estudado em camundongos. Este estudo tem como objetivo apresentar um método laboratorial objetivo que possa ajudar a estudar a reação do CHS em camundongos, que pode ser medido e quantificado por vários testes. Para induzir o CHS, no dia "0", os camundongos foram sensibilizados em um local previamente raspado por pintura de pele abdominal com a mistura hapten 2,4,6-trinitrcloobenzeno (TNCB) em uma mistura acetona-etanol, enquanto os ratos de controle negativo foram falsos sensibilizados com a mistura veículo sozinho-acetona-etanol. No dia "4", a espessura da orelha da linha de base foi medida com um micrômetro antes da obtenção de CHS (desafio) pintando ambas as orelhas com TNCB diluído tanto nos grupos de teste quanto de controle. Após 24h, o inchaço da orelha foi medido com um micrômetro. O CHS é um exemplo de resposta imune mediada por células T que causa inchaço no tecido inflamado, atingindo 24 h após o desafio da pele com o mesmo hapten. Aumento do edema de ouvido correlacionado com aumento do peso do ouvido, atividade mieloperoxidase (MPO), concentração pró-inflamatório de citocina nos extratos de ouvido, aumento do espessamento do edematoso no exame histológico e permeabilidade vascular do ouvido. Houve também um aumento na concentração de anticorpos IgG1 específicos do TNP na sera do grupo de teste quando comparado com os camundongos de controle. Além disso, o CHS pode ser transferido com sucesso com as células efeito CHS obtidas de doadores previamente sensibilizados com tncb. As células com efeito CHS foram administradas por via intravenosa em camundongos receptores ingênuos, que foram posteriormente desafiados com o mesmo hapten diluído. O inchaço da orelha foi medido com um micrômetro 24 h depois.

Introduction

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A dermatite de contato alérgica (ACD) é uma doença inflamatória da pele comum em países industrializados causada por uma reação de hipersensibilidade tipo IV resultante da exposição a produtos químicos de baixo peso molecular chamados haptens. As substâncias que causam sensibilização de contato em humanos incluem íons de metal pesado (cromo, níquel, ferro, cobalto), terebintina, fragrâncias, corantes e conservantes presentes em cosméticos (por exemplo, p-fenilediamina), algumas drogas (por exemplo, neomicina, benzocaína), antibióticos β-lactam (ou seja, penicilina), produtos químicos produzidos por plantas (pentadecacatechol, substância presente na hera venenosa), bem....

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Protocol

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Todos os experimentos apresentados neste artigo foram realizados de acordo com as diretrizes do 1º Comitê De Ética Local em Testes em Animais em Cracóvia. Todos os procedimentos descritos foram realizados de acordo com as recomendações locais, especialmente no que se refere ao uso de cetamina/xilazina como anestésico, utilizando ambos os lados das orelhas para aplicar a substância/hapten, cortando a orelha e coletando sangue por remoção do globo ocular. FORAM utilizados para o presente estudo os camundongos machos e fêmeas BALB/c (haplotype H-2d), CBA/J (H-2k) e C57BL/6 (H-2b), com idade entre 6 e 12 semanas. Para sign....

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Results

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Para indução de CHS, os animais foram sensibilizados através da pintura da pele (abdominal) com 150 μL de 5% de TNCB ou farsa sensibilizada apenas com o veículo. No dia "4", as respostas de inchaço de ouvido de ambas as orelhas foram induzidas pela pintura de contato (desafio) com 10 μL de 0,4% de TNCB em ambos os camundongos anteriormente em contato sensibilizado com tncb (grupo de teste) e os ratos do grupo controle (falsos sensibilizados). Os dados apresentados descrevem que os camundongos sensibilizados com .......

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Discussion

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O CHS é induzido através de haptens, que se ligam a antígenos auto-proteína na pele, criando neoantígenos. O CHS é mediado pelo recrutamento extravascular local de células T com efeito de antígeno circulante, o que resulta em inchaço no tecido desafiado, atingindo 24 h após a exposição da pele secundária ao mesmo hapten6. O inchaço do tecido é causado principalmente pela infiltração de leucócitos e deposição de fibrina dependente de leucócitos24. Essas alterações p.......

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Disclosures

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Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

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Este estudo foi apoiado pela subvenção SUBZ. A020.22.060 da Universidade Médica de Wroclaw, Polônia, e por subvenções do Ministério da Ciência e Educação Superior N401 545940 para MS e IP2012 0443 72 para MMS.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Etanol 70%Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha65350-Mpara desinfecção
de superfície Placas de fundo plano de 96 poços, polipropilenoGreiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Áustria655101para MPO e medição azul de Evans - as placas devem ser feitas de polipropileno, que tem uma capacidade de ligação menor, de modo que proteínas ou DNA não se liguem
acetona (reagente ACS, etc; 99,5%)Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha179124
Folha de alumínioMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaZ185140
Balança analíticaSartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, AlemanhaPRACTUM224-1s, 29105177
Processador automatizado de tecidosMediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, ÍndiaMTP-E-212preparar automaticamente amostras de tecido fixando, desidratando, limpando e infiltrando-as com parafina
BD Vacutainer SST II Advance (tubo com gel para obtenção de soro)Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, EUABD
Kit de ácido bicinchonínico para determinação de proteínasMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaBCA1-1KT
Biotina Rato Anti-Rato IgG1Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, EUA553441
BSA (albumina de soro bovino)Merck KGaA, Darmstadt, AlemanhaA9418, filtro de células de 2 mg/mL
, tamanho dos poros 70 μ mBIOLOGIX, China15-1070adequado para tubos de 50 mL
CoverslipVWR, Radnor, Pensilvânia, Estados Unidos631-158324 mm, mas é possível usar tamanhos diferentes
Capacidade de pipetas descartáveis: 5 mL, 10 mL, 25 mLMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaZ740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′ s solução salina tamponada com fosfato)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, EUA14190144 sem cálcio, sem magnésio, cultura de células de mamíferos
DPX Mountant para histologiaMerck KGaA, Darmstadt, Alemanha6522meios de montagem para HE, pode ser usado algum outro, por exemplo, bálsamo do Canadá
Pinças Dumont 5 - retasAnimalab, Poznan, Polônia11251-10FSTinstrumentos cirúrgicos para procedimentos em camundongos (devem ser esterilizados)
Pinças Dumont 7 - dobradasAnimalab, Poznan, Polônia11272-50FSTinstrumentos cirúrgicos para procedimentos em camundongos (devem ser esterilizados)
Solução de eosina Y, alcoólicaMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaHT110116
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1,5 mLEppenforf, Alemanha3,01,20,086polipropileno
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2,0 mLEppenforf, Alemanha3,01,20,094polipropileno, fundo redondo (os grânulos de homogeneização podem se mover facilmente)
Etanol 100% (álcool absoluto)Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha1.07017
Etanol 96%Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha1.59010
Evans blueMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaE2129
FBS (soro bovino fetal)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA
Solução de formalina, tamponada neutra, 10%Merck KGaA, Darmstadt, AlemanhaHT501128
Formamida 99,5% (GC)Merck KGaA, Darmstadt, AlemanhaF7503
Freezer -20 ° CBosch, AlemanhaGSN54AW30
Frigorífico +4 ° C / freezer -20 & CBosch, AlemanhaKGV36V10de células de mamíferos, qualificado, Brasil, 10 x 50 mL
Lâminas de microskope de vidro, SuperFrost PlusVWR, Radnor, Pensilvânia, Estados Unidos631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449Lâminas que eliminam a necessidade de aplicar materiais adesivos ou revestimentos de proteínas, para evitar a perda de seções de tecido durante a coloração.
Graph Pad PrismGraphPad Software Inc.v. 9.4.0
Sabonete cinzaPollena Ostrzeszó w, Produtor Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., PolôniaSabonete em barra cinza Bialy jelenSabonete em barra Natural Hipoalergênico. Produto disponível para o público em geral
H2SO4 (ácido sulfúrico) 1 mol/l (1 M)Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha1.60313
Solução de hematoxilina HarrisMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaHHS16
VWR, Avantor, EUA612-5719câmara de contagem manual, que é mais precisa
Brometo de hexadeciltrimetilamônioMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaH5882
HomogeneizadorQIAGEN Hilden, AlemanhaTissue Lyser LT, SN 23.1001/05234homogeneizador com esferas de aço inoxidável (diâmetro 5 mm) para tubos de centrífuga de 2 mL
Peroxidase de rábano estreptavidina (HRP estreptavidina)Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, EUASA-5004-1
Solução de peróxido de hidrogênio (H202)Merck KGaA, Darmstadt, AlemanhaH1009
Incubadora Heracell 150iThermo Electron LED Gmbh, Alemanha4107106837 oC na atmosfera de 5% CO2 e 65 0C para desparafinização das seções para histologia
Cetamina 100 mg/mL, solução injetávelBiowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Polóniacat.# não disponível
KH2PO4 (di-hidrogenofosfato de potássio) 99,995% de base anidraMerck KGaA, Darmstadt, Alemanha1.05108
Centrífuga de laboratórioHeraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, AlemanhaB00013899velocidade de 300 x g, com arrefecimento a 4 0C
Centrífuga de laboratórioHeraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Alemanha75002425velocidade de 3.000 x g, com resfriamento a 4 0C
Mask (FFP2)VWR, Radnor, Pensilvânia, Estados Unidos111-0917para trabalhar com camundongos dicloridrato de ortodianisina
Unidade de melhoramento da Cátedra de Ciências Biomédicas, Faculdade de Ciências da Saúde, Faculdade de Medicina da Universidade Jaguelônica, Cracóvia, PolôniaCBA/J, C57BL/6
MicrômetroMitutoyo, Tóquio, Japão193-111dígitos Micrômetro Externo, Parada de Catraca, Alcance 0-25mm, Graduação 0.001mm, Precisão +/-0.002mm, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml  
microplaca, 96 poços, microlon, alta ligação (para teste ELISA)Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Áustria655061com superfícies de ligação maxi-sorp para resultados confiáveis e reprodutíveis em ensaios colormétricos
Microscópio com objetivasLeica Microsystems CMS GmbH, AlemanhaDM1000, 294011-082007A histologia apresentada no artigo foi realizada sob o ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, com objetivos: FL 20X LWDPH, 0,40NA/3,1WD e FL 40X LWDPH 0,65NA/1,79WD
Mieloperoxidase de leucócitos humanos (padrão MPO)Merck KGaA, Darmstadt, AlemanhaM6908
Na2HPO4 x 7 H2O (fosfato de sódio dibásico heptahidratado)Merck KGaA, Darmstadt, AlemanhaS9390
AzeiteMerck KGaA, Darmstadt, Alemanha75343rato OptEIA puro
e natural IFN-&gama; Conjunto ELISABecton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, EUA555138
Cloridrato de ortodianisinaMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaD3252
Cera de parafinaMerck KGaA, Darmstadt, Alemanha76242contas, PBS sólido ceroso
(solução salina tamponada com fosfato)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, EUA20012027pH 7,2, medidor de ph para cultura de células de mamíferos
Elmetron, PolôniaCP-401
Pipetas, volume variável com ponteirasMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaEP3123000900-1EA3-pack, Opção 1, 0,5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, inclui epT.I.P.S.
Lâmina de barbearVWR, Radnor, Pensilvânia, Estados UnidosPERS94-0462lâminas raspadoras e cortadoras, borda única, lombada de alumínio, 100 lâminas por caixa, embaladas individualmente
Micrótomo rotativoMRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UKHIS-202A
Tesoura - reta, afiada / afiadaAnimalab, Poznan, Polônia14060-10FSTInstrumentos cirúrgicos para procedimentos em camundongos (devem ser esterilizados)
Tampa de rosca (topo aberto)Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha27056tampa de furo de polipropileno preto, para uso com 22  frasco de mL com espectrofotômetro de 20-400 fios
BioTek Instruments, EUA201446espectrofotômetro de microplacas universal: λ faixa: 200 - 999 nm, faixa de medição de absorbância: 0,000 - 4,000 Abs
Placa de coloração 20 lâminas com rackMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaS6141por exemplo, 20 placas de coloração de lâminas completas com tampas, suporte de lâminas e alça
Punção de biópsia descartável estéril 6mmIntegra LifeSciences, Princeton, NJ, EUA33-36
Tesoura cirúrgicaAnimalab, Poznan, Polônia52138-46instrumentos cirúrgicos para procedimentos em camundongos (devem ser esterilizados)
de processamento de tecidosMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaZ672122de processamento/incorporação de tecidos com tampa
Conjunto de reagentes de substrato TMBBecton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, EUA555214
TNCB (2,4,6-trinitroclorobenzeno)Tokyo Chemical Industry CO., LTD, JapãoC0307
TNP-BSA (albumina de soro bovino conjugada com 2,4,6-trinitrofenil)Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, EUAT-5050
T-PER (reagente de extração de proteína tecidual)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA78510
Tubos de 15 mL estéreisMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaCLS430055 (Corning)polipropileno, fundo cônico
Tubos de 50 mL, estérilMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaCLS430290 (Corning)polipropileno, fundo cônico
Tween 20Merck KGaA, Darmstadt, AlemanhaP1379
Frascos de frasco, tampa de rosca, vidro transparente (somente frasco) 22 mLMerck KGaA, Darmstadt, Alemanha27173para a preparação de hapteno, aparafusado de modo a não evaporar
Banho-mariaAJL Electronic, PolóniaLW102
Dispensador de cera (parafina)VWR, Radnor, Pensilvânia, Estados Unidos114-8737
Xilazina (xilapan 20 mg/ml) solução injetávelVetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Polóniacat.# não disponível
Xileno (grau histológico)Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha534056
à 366882 Ensaios e análises de proteínas A3160802 cultura Recomenda-se o hemocitômetro

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nosbaum, A., Vocanson, M., Rozieres, A., Hennino, A., Nicolas, J. F. Allergic and irritant contact dermatitis. European Journal of Dermatology. 19 (4), 325-332 (2009).
  2. Hertl, M., et al. Predominance of epiderma....

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