نظام ثنائي الطبقة الدهنية المدعوم بشريط نانوي لدراسة بروتينات استشعار انحناء الغشاء في المختبر
Summary
هنا ، تم تطوير نظام ثنائي الطبقة الدهنية المدعوم بشريط نانوي لتوفير غشاء اصطناعي بانحناء محدد يتيح توصيف البروتينات مع القدرة على استشعار الانحناء في المختبر.
Abstract
يلعب انحناء الغشاء أدوارا مهمة في مختلف العمليات الأساسية للخلايا ، مثل هجرة الخلايا وانقسام الخلايا والاتجار بالحويصلات. لا يتم إنشاؤه بشكل سلبي فقط من خلال الأنشطة الخلوية ، ولكن أيضا ينظم بنشاط تفاعلات البروتين ويشارك في العديد من الإشارات داخل الخلايا. وبالتالي ، من المفيد للغاية دراسة دور انحناء الغشاء في تنظيم توزيع وديناميات البروتينات والدهون. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير العديد من التقنيات لدراسة العلاقة بين الغشاء المنحني والبروتين في المختبر. بالمقارنة مع التقنيات التقليدية ، توفر الطبقة الثنائية الدهنية المدعومة بالقضيب النانوي (SLB) المطورة حديثا إنتاجية عالية ودقة أفضل في توليد انحناء الغشاء من خلال تشكيل طبقة ثنائية دهنية مستمرة على صفائف منقوشة من القضبان النانوية مع انحناء غشاء محدد مسبقا وتحكم مسطح محلي. يمكن توصيف كل من سيولة الدهون وحساسية البروتين للأغشية المنحنية كميا باستخدام التصوير المجهري الفلوري. هنا ، يتم تقديم إجراء مفصل حول كيفية تشكيل SLB على الأسطح الزجاجية المصنعة التي تحتوي على صفائف نانوية وتوصيف البروتينات الحساسة للانحناء على SLB هذا. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تغطية بروتوكولات إعادة استخدام الرقائق النانوية ومعالجة الصور. بالإضافة إلى nanobar-SLB ، فإن هذا البروتوكول قابل للتطبيق بسهولة على جميع أنواع رقائق الزجاج ذات البنية النانوية لدراسات استشعار الانحناء.
Introduction
انحناء الغشاء هو معلمة فيزيائية حرجة للخلية تحدث في مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية مثل التشكل وانقسام الخلايا وهجرة الخلايا1. من المعترف به على نطاق واسع الآن أن انحناء الغشاء يتجاوز نتيجة بسيطة للأحداث الخلوية. بدلا من ذلك ، برز كمنظم فعال لتفاعلات البروتين والإشارات داخل الخلايا. على سبيل المثال ، تم العثور على العديد من البروتينات المشاركة في التداخل الخلوي بوساطة الكلثرين ترتبط بشكل تفضيلي بالغشاء المنحني ، مما يؤدي إلى تكوين نقطة ساخنة للداخل الخلوي2. هناك العديد من الأسباب المختلفة لتشوه الغشاء مثل سحب الغشاء بواسطة قوى الهيكل الخلوي ، ووجود عدم تناسق الدهون مع مجموعات الرأس ذات الأحجام المختلفة ، ووجود بروتينات عبر الغشاء ذات شكل مخروطي ، وتراكم البروتينات المكونة للغشاء مثل بروتينات مجال BAR (سميت على اسم بروتينات Bin و amphiphysin و Rvs) ، وإدخال مجال الحلزونات البرمائية في الغشاء1 . ومن المثير للاهتمام أن هذه البروتينات والدهون لا تشوه الغشاء فحسب ، بل يمكنها أيضا استشعار انحناء الغشاء وإظهار تراكم تفضيلي1. لذلك ، من الأهمية بمكان دراسة ما إذا كانت الأغشية ذات الانحناءات المختلفة تغير توزيع وديناميكيات البروتينات والدهون المرتبطة بها وكيف تغير التأثيرات المحتملة على العمليات داخل الخلايا ذات الصلة.
تم تطوير العديد من التقنيات لتحليل التفاعل بين الغشاء المنحني والبروتينات في كل من الخلايا الحية وأنظمة المختبر. يوفر نظام الخلية الحية بيئة خلية حقيقية مع تنوع غني للدهون وتنظيم إشارات البروتين الديناميكي2،3،4،5،6،7. ومع ذلك ، يصعب دراسة مثل هذا النظام المتطور بسبب عدم اليقين والتقلبات في البيئة داخل الخلايا. ومن ثم ، فإن المقايسات في المختبر باستخدام غشاء اصطناعي يتكون من أنواع الدهون المعروفة والبروتينات النقية أصبحت أنظمة إعادة تكوين قوية لتوصيف العلاقة بين البروتينات والأغشية المنحنية. تقليديا ، يتم إنشاء الجسيمات الشحمية بأقطار مختلفة عن طريق البثق للكشف عن البروتينات الحساسة للانحناء إما عن طريق مقايسة الترسيب المشترك باستخدام قوة الطرد المركزي أو مقايسة التعويم المشترك مع تدرج الكثافة لتجنب تراكم البروتين 8,9. ومع ذلك ، فإن انحناء الجسيمات الشحمية المبثوقة محدود بحجم المسام المتاح لمرشح الغشاء المستخدم في الطارد10. وقد ثبت أن مقايسة انحناء الجسيمات الشحمية المفردة (SLiC) تتغلب على هذا القيد ، حيث يتم تمييز الجسيمات الشحمية بأقطار مختلفة بالتألق وتثبيتها على السطح بحيث يمكن تمييز الانحناء بكثافة الفلورسنت11. ومع ذلك ، فقد لوحظ تباين قوي في تكوين الدهون في الحويصلات الصغيرة ، مما يؤثر على دقة قياس الانحناء12. توفر تجارب سحب الحبل قياسا أكثر دقة للانحناء على الحبل العابر المسحوب من الحويصلات العملاقة أحادية الصفيحة (GUVs) باستخدام ملقط بصري ، حيث يمكن التحكم في الانحناء جيدا بواسطة توتر الغشاء الناتج13,14. هذه الطريقة مناسبة لدراسة بروتينات استشعار الانحناء الإيجابي أو السلبي ، ولكنها مقيدة بإنتاجية توليد الأنبوب10. يوفر فحص الأنابيب الغشائية المدعومة (SMrT) توليدا متزامنا لأنابيب غشائية متعددة يتم بثقها من نفس خزان الدهون بواسطة تدفقات الموائع الدقيقة. ومع ذلك ، يختلف انحناء الغشاء جوهريا على طول الأنبوب النانوي ، مما يضر بدقة قياس الانحناء القائم على شدة التألق15,16. وبالمقارنة ، فإن استخدام حويصلات صغيرة أحادية الصفيحة (سيارات الدفع الرباعي ، قطرها <100 نانومتر17) لتشكيل طبقة ثنائية دهنية مدعومة (SLB) على الأسطح التي تحتوي على طبوغرافيات مصممة ولدت غشاء أحادي الطبقة مع انحناءات محددة مسبقا بواسطة التصنيع النانوي أو المواد النانوية بدقة عالية18،19،20.
هنا ، نقدم بروتوكولا لتشكيل SLB على أسطح رقاقة نانوية مصنعة مع صفائف نانوية وكيف يمكن استخدامه لاستكشاف حساسية انحناء البروتينات في المختبر. كما هو موضح في الشكل 1 ، هناك ستة مكونات أساسية للفحص: أ) تنظيف وتجميع الرقاقة بغرفة الموائع الدقيقة ؛ ب) تحضير سيارات الدفع الرباعي ذات التركيب الدهني المحدد ؛ ج) تشكيل SLB على رقاقة نانوية وملزمة ببروتينات حساسة للانحناء ؛ د) تصوير وتوصيف SLB والبروتينات الحساسة للانحناء تحت المجهر الفلوري ؛ ه) تنظيف الرقاقة لإعادة استخدامها ؛ و) معالجة الصور للتحليل الكمي لقدرة استشعار انحناء البروتين. يتم وصف البروتوكول التفصيلي خطوة بخطوة أدناه.
Protocol
Representative Results
Discussion
يقدم نظام nanobar-SLB الموصوف هنا مزيجا فريدا من المزايا في العديد من المقايسات الموجودة في المختبر. يكشف بكفاءة عن الارتباط التفضيلي للبروتينات بالأغشية المنحنية للغاية مثل مقايسة تعويم الجسيمات الشحمية أو الترسيب ولكنه يتطلب عينات أقل بكثير ويوفر انحناءا محددا بدقة أكبر على قضبان نان?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر مركز نانيانغ للتصنيع النانوي (N2FC) ومركز التقنيات الضوئية التخريبية (CDPT) في جامعة نانيانغ التكنولوجية (NTU) لدعم تصنيع البنية النانوية والتصوير SEM ، ومنصة إنتاج البروتين (PPP) في كلية العلوم البيولوجية NTU لتنقية البروتين ، وكلية الهندسة الكيميائية والطبية الحيوية NTU للمجهر متحد البؤر. يتم تمويل هذا العمل من قبل وزارة التعليم السنغافورية (MOE) (W. Zhao و RG112/20 و RG95/21 و MOE-T2EP30220-0009) ، ومعهد التحليلات الجزيئية الرقمية والعلوم (IDMxS) بدعم من تمويل وزارة التربية والتعليم في إطار مخطط مراكز التميز البحثية (W. Zhao) ، ومؤسسة برنامج علوم الحدود البشرية (W. Zhao ، RGY0088/2021) ، ومنحة NTU Start-up Grant (W. Zhao) ، كلية الهندسة الكيميائية والطبية الحيوية NTU للمنحة البحثية (X. Miao) ، ومجلس المنح الدراسية الصيني للمنحة البحثية (J. Wu).
Materials
| Anhydrous Ethanol | Sigma-Aldrich | 100983 | |
| Aluminum foil | Diamond | RN0879999FU | |
| Amber Vial | Sigma-Aldrich | 27115-U | |
| Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840032 | |
| 10 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211060804 | |
| 50 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211061706 | |
| 1000 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211065408 | The second container |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | V800117 | |
| Cotton buds | Watsons | ||
| 18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 790404 | |
| Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840051 | |
| F-BAR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| F-BAR+IDR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GFP | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GFP-His | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GraphPad Prism | GraphPad | V9.0.0 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) | Thermo Scientific | H325-500 | |
| IDR from human FBP17 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.50d | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss | LSM 800 with Airyscan | 100x (N.A.1.4) oil objective. |
| Methanol | Fisher scientific | 10010240 | |
| Mini-extuder | Avanti Polar Lipids, Inc. | 610000-1EA | |
| 1.5 mL Microtubes | Greiner | 616201 | |
| MATLAB | Mathworks | R2018b | |
| Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm | Whatman | 800309 | |
| Phosphate Bufferen Saline (PBS) | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | 70013 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Base | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | PDC-002-HP | |
| Quartz Nanochip | Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | T1395MP | |
| Tweezer | Gooi | PDC-002-HP | |
| Ultrasonic Cleaners | Elma | D-78224 | |
| Voterx | Scientific Industries | G560E | |
| Vacuum Desiccator | NUCERITE | 5312 | |
| Water Bath | Julabo | TW8 |
Referências
- McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
- Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).
- Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
- Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).
- Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
- Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).
- Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).
- Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).
- Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
- Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).
- Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
- Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
- Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).
- Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).
- Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).
- Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).
- Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).
- Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).
- Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
- Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
- Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).
- Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).
- Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).
- Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).
- Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).
- Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).
- El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).
- Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).
- Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).
- Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
- Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
- Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).
- Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
- Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).
- Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).
- Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).
- Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).
- Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).
- Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).
- Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).
- Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).
- Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).
- London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).
- Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).
- Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).
- Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).
- Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).
