يتم تسهيل الكشف عن الهدف القائم على Aptamer بواسطة تفاعل تضخيم أسي متساوي الحرارة G-quadruplex من 3 مراحل

Summary

يوضح البروتوكول الحالي استخدام مقايسة تضخيم أسي سريعة من 3 مراحل قائمة على aptamer للكشف عن الأهداف. يتم تغطية تحضير العينة وتضخيم الإشارة وتطوير اللون لتنفيذ هذا النظام للتعرف على وجود الثيوفيلين على الكافيين.

Abstract

الأبتامير هي جزيئات التعرف على الهدف التي ترتبط بتقارب وخصوصية عالية. يمكن الاستفادة من هذه الخصائص للتحكم في الجزيئات الأخرى ذات القدرة على توليد الإشارة. بالنسبة للنظام الموصوف هنا ، فإن التعرف على الهدف من خلال مجال aptameric ، Stem II من ريبوزيم رأس المطرقة المعدل ، ينشط الريبوزيم ذاتي الشق عن طريق تثبيت البنية غير المنظمة في البداية. يعمل الحمض النووي الريبي المشقوق لرابطة الدول المستقلة عند تقاطع الجذع الثالث والجذع الأول ، مما يخلق منتجين للانقسام. يقوم منتج الانقسام الأطول بإعداد تفاعل تضخيم أسي متساوي الحرارة (EXPAR) لاثنين من رباعيات G النشطة تحفيزيا المتشابهة. تحفز منتجات التضخيم الناتجة عن ذلك تقليل البيروكسيديز ، والذي يقترن بتقليل الركيزة اللونية بإخراج يمكن للعين المجردة اكتشافه. يعمل النظام المكون من 3 أجزاء الموصوف في الدراسة الحالية على تحسين طرق الكشف مثل مقايسات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISAs) من خلال إنتاج إشارة يمكن اكتشافها بصريا للإشارة إلى وجود ما يصل إلى 0.5 ميكرومتر من الثيوفيلين في أقل من 15 دقيقة.

Introduction

عادة ما تكون الأبتامير عبارة عن حمض نووي أو حمض نووي ريبوزي أحادي الشريط يتم اختياره من خلال عملية تطورية ذات تقارب ارتباط عالي وخصوصية للأهداف المرجوة¹. بالإضافة إلى القدرة على الربط ، يمكن ربط aptamers بالزخارف والتحكم فيها باستخدام وظائف خرج الإشارة ^2,3 ، مما يؤدي إلى تضخيم الإشارة المذكورة وتحسين حساسية النظام. نظام تفاعل التضخيم الأسي متساوي الحرارة G-quadruplex (GQ-EXPAR) هو نظام من ثلاثة أجزاء (الشكل 1) يطور إشارة مرئية حيث تتم إضافة مكونات متتالية إلى وعاء تفاعل واحد لإنتاج ناتج مرئي⁴. يسمح هذا النظام بالكشف عن هدف محدد ، هنا الثيوفيلين ، في عينة معينة في غضون 15 دقيقة باستخدام سير عمل مبسط للسماح بالكشف السريع والمحدد عن هدف الاهتمام. يجب النظر في هذه الطريقة للعينات التي يكون فيها التحديد الكمي المحدد للتركيز المستهدف أقل إثارة للقلق من الخصوصية العالية للاستجابة في فترة زمنية قصيرة.

ينتج الريبوسويتش الخيفي ، وهو جزيء RNA لتبديل البنية (ريبوزيم) يخضع للانقسام الذاتي ، الإشارة الأولية. يعتمد هذا البناء على ريبوزيم رأس المطرقة ، مع إدخال مجال أبتاميري في Stem II كمنظم لنشاط الانقسام. يتم تنشيط وظيفة الانقسام الذاتي عندما يستقر مجاله aptameric عند الارتباط بهدفه⁵. خلاف ذلك ، يكون المفتاح غير نشط في حالته الأصلية.

يستخدم تفاعل التضخيم الأسي اللاحق (EXPAR) إطلاق شريط الحمض النووي الريبي المشقوق ذاتيا من المرحلة الأولى لتجهيز تفاعل تضخيم متساوي الحرارة⁶. يحتوي منتج التضخيم الخاص ب EXPAR على نشاط البيروكسيديز⁷ ، حيث يعمل كأساس للمرحلة الأخيرة من النظام. عندما تتأكسد بعض الركائز بالتزامن مع انهيار البيروكسيد ، فإنها تنتج ناتج فلورسنت يمكن قياسه على أجهزة مختلفة. يمكن استبدال الركائز الشائعة الأخرى لإنتاج منتج ملون للكشف البصري. EXPAR ونشاط البيروكسيديز لمنتجات التضخيم الخاصة به بمثابة محسن إشارة 2-stage ، وزيادة الحساسية لمستويات أعلى مقارنة بالاستراتيجيات التقليدية ^7,8.

يستخدم الكشف عن الثيوفيلين مقابل الكافيين كمثال على خصوصية منصة الكشف هذه ، حيث تختلف عن طريق مجموعة ميثيل واحدة فقط (الشكل 2). ينتج هذا العرض التوضيحي للنظام ناتجا لونيا للكشف البصري عن 500 نانومتر ثيوفيلين على الأقل.

Protocol

انظر الجدول التكميلي 1 (جدول إعداد التفاعل) لتحضير الأنبوب، بما في ذلك الأحجام والتركيزات المحددة لمكونات التفاعل. يستخدم البروتوكول الموضح هنا مجموعة منصات الكشف المجمعة مسبقا كما هو موضح في جدول المواد. يجب حفظ جميع المكونات على الجليد ما لم يذكر خلاف ذلك. <p class="jove_titl…

Representative Results

تقوم منصة الكشف الموضحة في الشكل 1 بتحويل التعرف على الهدف aptameric إلى اختلافات متميزة بصريا بين مستحضرات العينة (الهدف مقابل غير الهدف ، الشكل 2) في فترة زمنية قصيرة. كان الريبوزيم الخيفي الذي حدده Soukup et al.5 بمثابة نقطة انطلاق لإنشاء تسلسل أقل ضوضا…

Discussion

تستفيد الطريقة المعروضة هنا من الانتقال بين بنية ثانوية مضطربة في البداية في ريبوزيم خيفي والاستقرار الإضافي الممنوح من خلال ربط الهدف بالمجال الأبتاميري لتنشيط ريبوزيم رأس المطرقة المشقوق لرابطة الدول المستقلة. تم تعديل استقرار الريبوزيم لتقليل النشاط التحفيزي في غياب الهدف مع السماح…

Materials

3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution"	PerkinElmer	FOOD-1806-1000	Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2.
5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3.
5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5x Ribozyme Buffer	Aptagen, LLC	N/A	5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4.
Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit	Aptagen, LLC	GQ-EXPAR-TMB	The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group.
Bst 2.0 DNA polymerase	New England Biolabs	M0537S	Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
Buffer 3.1	New England Biolabs	B6003SVIAL	Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750-100G	Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1.
dNTPs	New England Biolabs	N0447S	Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
EXPAR reaction mixture	Aptagen, LLC	N/A	0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Hemin	Sigma-Aldrich	H9039	Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1.
Isothermal Amplification Buffer	New England Biolabs	B0537SVIAL	Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
MgCl2	Amresco (VWR)	E525-500ML	Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3.
MJ PTC-100 Thermocycler	MJ Research, Inc.	PTC-100	Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used.
N, N-Dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	227056-100ML	Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1.
Nickase-polymerase Mix	Aptagen, LLC	N/A	Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1.
Nt.BstNBI	New England Biolabs	R0607S	Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
T4 Kinase Buffer	New England Biolabs	B0201SVIAL	Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.
T4 polynucleotide kinase	New England Biolabs	M0201S	Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes.
Tecan GENios FL	Tecan	Genios-FL TWT	Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results.
Theophylline	Sigma-Aldrich	T1633-50G	Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2.
Tris-HCl	American Bioanalytical	AB14043-01000	Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.