זיהוי מטרות מבוסס Aptamer המתאפשר על ידי תגובת הגברה מעריכית איזותרמית G-Quadruplex תלת-שלבית
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מדגים את השימוש בבדיקת הגברה מעריכית מהירה, תלת שלבית, מבוססת אפטמר כדי לזהות מטרות. הכנת דגימות, הגברת אותות ופיתוח צבע מכוסים כדי ליישם מערכת זו כדי לזהות נוכחות של תיאופילין על פני זה של קפאין.
Abstract
Aptamers הן מולקולות זיהוי מטרה שנקשרות עם זיקה גבוהה וספציפיות. ניתן למנף מאפיינים אלה כדי לשלוט במולקולות אחרות בעלות יכולת יצירת אותות. עבור המערכת המתוארת כאן, זיהוי מטרה באמצעות תחום אפטמרי, Stem II של ריבוזימי ראש פטיש שונה, מפעיל את הריבוזיום המתבקע מעצמו על ידי ייצוב המבנה הבלתי מובנה הראשוני. הרנ”א החותך פועל בצומת של גזע III וגבעול I, ויוצר שני תוצרי מחשוף. מכפלת המחשוף הארוכה יותר יוצרת תגובת הגברה מעריכית איזותרמית (EXPAR) של שני מרובעי G פעילים קטליטית דומים. תוצרי ההגברה המתקבלים מזרזים הפחתת פרוקסידאז, המשולבת להפחתה של מצע קולורימטרי עם פלט שהעין הבלתי יכולה לזהות. המערכת בת 3 החלקים המתוארת במחקר הנוכחי משפרת את שיטות הזיהוי כגון בדיקות אימונוסורבנטיות מקושרות אנזימים (ELISAs) על ידי הפקת אות חזותי הניתן לזיהוי לציון נוכחות של תאופילין נמוך עד 0.5 מיקרומטר תוך 15 דקות בלבד.
Introduction
Aptamers הם בדרך כלל DNA חד גדילי או RNA שנבחר בתהליך אבולוציוני עם זיקה גבוהה קישור וספציפיות למטרות הרצויות1. בנוסף ליכולת הקשירה, ניתן לקשר ולשלוט במוטיבים של אותפלט 2,3, להגביר את האות האמור ולשפר את רגישות המערכת. מערכת G-quadruplex איזותרמית מעריכית מעריכית (GQ-EXPAR) היא מערכת בת שלושה חלקים (איור 1) המפתחת אות חזותי כאשר רכיבים עוקבים מתווספים לכלי תגובה יחיד כדי להפיק פלט חזותי4. מערכת זו מאפשרת זיהוי של מטרה ספציפית, להלן תיאופילין, בדגימה נתונה תוך 15 דקות באמצעות זרימת עבודה יעילה המאפשרת זיהוי מהיר וספציפי של מטרה מעניינת. יש לשקול שיטה זו עבור דגימות שבהן כימות ספציפי של ריכוז המטרה הוא חשש נמוך יותר מאשר ספציפיות גבוהה של התגובה בזמן קצר.
ריבומתג אלוסטרי, מולקולת RNA מחליפת מבנה (ריבוזים) שעוברת פיצול עצמי, מייצרת את האות הראשוני. מבנה זה מבוסס על ריבוזימי ראש פטיש, עם תחום אפטמרי שהוכנס בגזע II כמווסת של פעילות המחשוף. פונקציית המחשוף העצמי שלו מופעלת כאשר התחום האפטמרי שלו מיוצב על קשירה למטרה5. אחרת, המתג אינו פעיל במצבו המקורי.
תגובת ההגברה המעריכית העוקבת (EXPAR) משתמשת בשחרור גדיל הרנ”א העצמי מהשלב הראשון לתגובת הגברה איזותרמית6. תוצר ההגברה של EXPAR הוא בעל פעילות פרוקסידז7, הפועל כבסיס לשלב האחרון של המערכת. כאשר חלק מהמצעים מחומצנים בשילוב עם פירוק מי חמצן, הם מייצרים פלט פלואורסצנטי שניתן למדוד על מכשור שונה. ניתן להחליף מצעים נפוצים אחרים כדי לייצר מוצר צבעוני לזיהוי חזותי. EXPAR ופעילות הפרוקסידז של מוצרי ההגברה שלה פועלים כמשפר אותות דו-שלבי, ומגבירים את הרגישות לרמות גבוהות יותר בהשוואה לאסטרטגיות קונבנציונליות 7,8.
הזיהוי של תאופילין לעומת קפאין משמש כדוגמה לספציפיות של פלטפורמת הזיהוי הזו, מאחר שהם נבדלים רק בקבוצת מתיל אחת (איור 2). הדגמה זו של המערכת מייצרת פלט קולורימטרי לזיהוי חזותי של לפחות 500 ננומטר תיאופילין.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המוצגת כאן מנצלת את המעבר בין מבנה משני לא מסודר בתחילה בריבוזימים אלוסטריים לבין היציבות הנוספת המוענקת באמצעות קשירת המטרה לתחום האפטמרי כדי להפעיל את ריבוזימי ראש הפטיש cis-cranking. יציבות הריבוזים הותאמה כדי למזער את הפעילות הקטליטית בהיעדר המטרה תוך מתן אפשרות לקשירת המטרה לשחזר ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מימון המחקר והפיתוח של Aptagen LLC.
Materials
| 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution" | PerkinElmer | FOOD-1806-1000 | Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2. |
| 5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| 5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3. |
| 5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| 5x Ribozyme Buffer | Aptagen, LLC | N/A | 5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4. |
| Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit | Aptagen, LLC | GQ-EXPAR-TMB | The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group. |
| Bst 2.0 DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1. |
| Buffer 3.1 | New England Biolabs | B6003SVIAL | Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-100G | Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1. |
| dNTPs | New England Biolabs | N0447S | Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| EXPAR reaction mixture | Aptagen, LLC | N/A | 0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1. |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537SVIAL | Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| MgCl2 | Amresco (VWR) | E525-500ML | Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3. |
| MJ PTC-100 Thermocycler | MJ Research, Inc. | PTC-100 | Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used. |
| N, N-Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056-100ML | Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1. |
| Nickase-polymerase Mix | Aptagen, LLC | N/A | Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1. |
| Nt.BstNBI | New England Biolabs | R0607S | Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1. |
| T4 Kinase Buffer | New England Biolabs | B0201SVIAL | Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4. |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes. |
| Tecan GENios FL | Tecan | Genios-FL TWT | Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results. |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633-50G | Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2. |
| Tris-HCl | American Bioanalytical | AB14043-01000 | Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4. |
Referências
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tang, J., Breaker, R. R. Rational design of allosteric ribozymes. Chemical Biology. 4 (6), 453-459 (1997).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX–A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
- Liao, A. M., et al. A simple colorimetric system for detecting target antigens by a three-stage signal transformation-amplification strategy. Bioquímica. 57 (34), 5117-5126 (2018).
- Soukup, G. A., Emilsson, G. A., Breaker, R. R. Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection. Journal of Molecular Biology. 298 (4), 623-632 (2000).
- Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
- Cheng, X., Liu, X., Bing, T., Cao, Z., Shangguan, D. General peroxidase activity of G-quadruplex-hemin complexes and its application in ligand screening. Bioquímica. 48 (33), 7817-7823 (2009).
- Nie, J., et al. Reporter-triggered isothermal exponential amplification strategy in ultrasensitive homogeneous label-free electrochemical nucleic acid biosensing. Chemical Communications. 50 (47), 6211-6213 (2014).
- Tabuchi, T., Yokobayashi, Y. Cell-free riboswitches. RSC Chemical Biology. 2 (5), 1430-1440 (2021).
- Ao, Y., et al. Integration of an expression platform in the SELEX cycle to select DNA aptamer binding to a disease biomarker. ACS Omega. 7 (12), 10804-10811 (2022).
