पाइरोसीक्वेंसिंग द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम में जीनोटाइपिंग सिंगल न्यूक्लियोटाइड पॉलीमोर्फिज्म
Summary
पायरोसीक्वेंसिंग परख हेटरप्लाज्मिक कोशिकाओं या ऊतकों में माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं की मजबूत और तेजी से जीनोटाइपिंग को सक्षम करती है।
Abstract
माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम (एमटीडीएनए) में उत्परिवर्तन मातृ विरासत में मिली आनुवंशिक बीमारियों से जुड़ा हुआ है। हालांकि, एमटीडीएनए म्यूटेनेसिस द्वारा मॉडल का उत्पादन करने की हाल ही में विकसित क्षमता और माइटोकॉन्ड्रियल आनुवंशिक विपथन और कैंसर, मधुमेह और मनोभ्रंश जैसी सामान्य उम्र से संबंधित बीमारियों के बीच संबंध की एक नई सराहना के कारण हाल के वर्षों में एमटीडीएनए बहुरूपताओं में रुचि बढ़ी है। पायरोसीक्वेंसिंग एक अनुक्रमण-दर-संश्लेषण तकनीक है जो नियमित जीनोटाइपिंग प्रयोगों के लिए माइटोकॉन्ड्रियल क्षेत्र में व्यापक रूप से नियोजित है। बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण विधियों और कार्यान्वयन में आसानी की तुलना में इसकी सापेक्ष सामर्थ्य इसे माइटोकॉन्ड्रियल आनुवंशिकी के क्षेत्र में एक अमूल्य तकनीक बनाती है, जिससे बढ़े हुए लचीलेपन के साथ हेटरोप्लाज्मी की तेजी से मात्रा का ठहराव होता है। इस पद्धति की व्यावहारिकता के बावजूद, एमटीडीएनए जीनोटाइपिंग के साधन के रूप में इसके कार्यान्वयन के लिए कुछ दिशानिर्देशों के अवलोकन की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से जैविक या तकनीकी मूल के कुछ पूर्वाग्रहों से बचने के लिए। यह प्रोटोकॉल हेटरोप्लाज्मी माप के संदर्भ में उपयोग के लिए पाइरोसीक्वेंसिंग परख को डिजाइन और कार्यान्वित करने में आवश्यक कदमों और सावधानियों को रेखांकित करता है।
Introduction
माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम मैट्रिक्स नामक माइटोकॉन्ड्रिया के सबसे भीतरी डिब्बे में मौजूद छोटे (16.5 केबी) परिपत्र अणुओं (एमटीडीएनए) के रूप में मौजूद है और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन श्रृंखला के 13 सबयूनिट्स को एन्कोड करता है, साथ ही माइटोकॉन्ड्रियल राइबोसोम1 द्वारा सीटू में उनके अनुवाद के लिए आवश्यक टीआरएनए और आरआरएनए भी है। यह जीनोम माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के लिए आवश्यक सभी प्रोटीनों के लगभग 1% का प्रतिनिधित्व करता है, जिनमें से शेष परमाणु डीएनए (एनडीएनए) द्वारा एन्कोड किए जाते हैं। यह आमतौर पर माना जाता है कि माइटोकॉन्ड्रिया एक अल्फा-प्रोटियोबैक्टीरियल पूर्वज और एक पैतृक यूकेरियोटिक कोशिका के बीच एक एंडोसिम्बायोटिक संलयन घटना से प्राप्त होते हैं। एक बार जब यह काल्पनिक सहजीवन हुआ, तो माइटोकॉन्ड्रिया की आनुवंशिक जानकारी धीरे-धीरे आयनों पर नाभिक में स्थानांतरित हो गई, जो आधुनिक सायनोबैक्टीरिया2 के जीनोम की तुलना में एमटीडीएनए की उपरोक्त कॉम्पैक्टनेस की व्याख्या करती है। जीन का ऐसा हस्तांतरण एनडीएनए के लंबे हिस्सों के अस्तित्व से सबसे दृढ़ता से प्रमाणित होता है जो एमटीडीएनए में पाए जाने वाले अनुक्रमों के लिए अत्यधिक समरूप हैं। ये परमाणु माइटोकॉन्ड्रियल अनुक्रम (NUMT) जीनोटाइपिंग के दौरान गलत व्याख्या का एक सामान्य स्रोत हैं, और जीनोटाइपिंग एमटीडीएनए3 (चित्रा 1 ए) के दौरान परमाणु पूर्वाग्रहों से बचने के लिए कुछ सावधानियां बरतनी चाहिए।
एमटीडीएनए की एक और विशिष्ट विशेषता यह है कि इसकी प्रतिलिपि संख्या सेल प्रकार के आधार पर भिन्न होती है, प्रति सेल4 में दसियों से हजारों प्रतियों तक की संख्या होती है। इस बहु-प्रतिलिपि प्रकृति के कारण, एमटीडीएनए एक एकल कोशिका के भीतर जीनोटाइप की एक विस्तृत श्रृंखला को परेशान कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप गुणसूत्रों की जाइगोसिटी पर विचार करते समय परमाणु जीन से जुड़े असतत एलील्स के विपरीत एलील्स का अधिक निरंतर वितरण हो सकता है। माइटोकॉन्ड्रियल एलील्स की इस विषमता को माइटोकॉन्ड्रियल हेटरोप्लाज्मी के रूप में जाना जाता है, जिसे आमतौर पर किसी दिए गए सेल में कुल एमटीडीएनए के अनुपात के रूप में किसी दिए गए उत्परिवर्तन के प्रतिशत प्रसार में व्यक्त किया जाता है। हेटरोप्लाज्मी को होमोप्लाज्मी के साथ विपरीत किया जा सकता है, जो एक सेल में मौजूद एमटीडीएनए की एक अनूठी प्रजाति को संदर्भित करता है।
रोगजनक वेरिएंट को परेशान करने वाले एमटीडीएनए अणुओं के अनुपात को निर्धारित करते समय माइटोकॉन्ड्रियल हेटरोप्लाज्मी को मापना विशेष रुचि का है। इस तरह के वेरिएंट एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एसएनपी), छोटे इंडेल, या बड़े पैमाने पर विलोपनके रूप में आते हैं। अधिकांश मनुष्य रोगजनक वेरिएंट के लिए हेटरप्लाज्मिक हैं; हालांकि, वे किसी भी नैदानिक फेनोटाइप का प्रदर्शन नहीं करते हैं, जो अक्सर केवल रोगजनक एमटीडीएनए के उच्च हेटरोप्लाज्मी स्तरों पर प्रकट होते हैं, जिसे थ्रेशोल्ड प्रभाव6 कहा जाता है। जबकि रोगजनकता से जुड़े मूल्य रोगजनक उत्परिवर्तन की प्रकृति और ऊतक पर अत्यधिक निर्भर होते हैं जिसमें यह होता है, वे आम तौर पर 60% हेटरोप्लाज्मी7 से ऊपर होते हैं।
कई शोध क्षेत्र हैं जिनमें माइटोकॉन्ड्रियल जीनोटाइपिंग आम है। चिकित्सा क्षेत्र में, एमटीडीएनए उत्परिवर्तन के लिए परीक्षण या मात्रा माइटोकॉन्ड्रियल रोगों के लिए नैदानिक मानदंड के रूप में काम कर सकती है, जिनमें से कई में एमटीडीएनए विपथन उनके मूलके रूप में हैं। मानव रोगजनक उत्परिवर्तन के अध्ययन के अलावा, एमटीडीएनए में रोगजनक एसएनपी को आश्रय देने वाले पशु मॉडल की व्यापकता बढ़ने की संभावना है, हाल ही में माइटोकॉन्ड्रियल रूप से लक्षित डीडीडीए-व्युत्पन्न साइटोसिन बेस एडिटर्स (डीडीसीबीई) 8 और टीएएल-आधारित डेमिनेज (टीएएलईडी) द्वारा सक्षम माइटोकॉन्ड्रियल बेस एडिटिंग के आगमन को देखते हुए।. यह दृष्टिकोण असामान्य माइटोकॉन्ड्रियल जीनोटाइप और परिणामस्वरूप शिथिलता के बीच परस्पर क्रिया को समझने में सहायक होगा। हेटेरोप्लाज्मी शिफ्टिंग के रूप में जाना जाने वाला दृष्टिकोण के माध्यम से मानव माइटोकॉन्ड्रियल रोगों में चिकित्सीय रणनीति के रूप में अंतिम उपयोग के लिए माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम को फिर से तैयार करने में वैज्ञानिक अनुसंधान भी चल रहा है। अनुसंधान के इस क्षेत्र में मुख्य रूप से माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में उत्परिवर्तन-विशिष्ट न्यूक्लियस को निर्देशित करना शामिल है; इसके परिणामस्वरूप रोगजनक एमटीडीएनए का अधिमान्य क्षरण होता है, जिससे फेनोटाइप10,11,12,13 में बचाव होता है। माइटोकॉन्ड्रियल जीनोटाइप के रीमॉडेलिंग से जुड़े किसी भी प्रयोग को हेटरोप्लाज्मी शिफ्ट का आकलन करने के लिए एक मजबूत मात्रात्मक विधि की आवश्यकता होती है।
एमटीडीएनए को जीनोटाइप करने के लिए विभिन्न प्रकार के तरीकों का उपयोग किया जाता है, और ये उत्परिवर्तन की प्रकृति के अनुसार भिन्न होते हैं। अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) विधियां अधिक सटीक हैं जब एमटीडीएनए में एसएनपी की मात्रा निर्धारित करने की बात आती है; हालांकि, माइटोकॉन्ड्रियल हेटरोप्लाज्मी के नियमित परिमाणीकरण के लिए ये विधियां निषेधात्मक रूप से महंगी रहती हैं, खासकर अगर नमूनों की संख्या छोटी है। सेंगर अनुक्रमण एसएनपी का पता लगाने के लिए भी अनुमति दे सकता है; हालांकि, यह दृष्टिकोण मात्रात्मक नहीं है और अक्सर हेटरोप्लाज्मी के निम्न स्तर का पता लगाने में विफल रहता है या उच्च हेटरोप्लाज्मी का अनुमान लगाते समय गलत हो सकता है। पाइरोसीक्वेंसिंग, एक परख के रूप में जिसमें न्यूनतम तैयारी शामिल है और किसी भी एमटीडीएनए नमूने के लिए हेटरोप्लाज्मी की तेजी से मात्रा का ठहराव करने में सक्षम बनाता है, इन दो चरम सीमाओं के बीच एक उपयुक्त समझौता के रूप में प्रस्तावित है। इस विधि का उपयोग विभिन्न संदर्भों में कई शोधकर्ताओं द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल एसएनपी को निर्धारित करने के लिए नियमित रूप से किया गया है, जिसमें फोरेंसिक विश्लेषण 14,15, नैदानिक निदान16, या एकल कोशिकाओं17 से एमटीडीएनए की जीनोटाइपिंग शामिल है।
इस परख में एमटीडीएनए में एसएनपी के किनारे एक क्षेत्र का पहला पीसीआर प्रीएम्प्लिफिकेशन चरण शामिल है, जिसके बाद पहले से उत्पन्न एम्प्लिकॉन के एक स्ट्रैंड का उपयोग करके अनुक्रमण-दर-संश्लेषण परख होती है। प्रीएम्प्लिफिकेशन चरण में उपयोग किए जाने वाले दो प्राइमरों में से एक को 5 ‘अंत पर बायोटिनीलेटेड किया जाना चाहिए, जो पाइरोसीक्वेंसिंग तंत्र को अनुक्रमण प्रतिक्रिया के लिए टेम्पलेट के रूप में उपयोग करने के लिए डीएनए के एकल स्ट्रैंड को अलग करने में सक्षम करेगा। एक तीसरे अनुक्रमण प्राइमर को तब बरकरार बायोटिनीलेटेड स्ट्रैंड पर लगाया जाता है, जो प्रतिक्रिया कक्ष में पूर्वनिर्धारित क्रम में डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड्स के रूप में नवजात डीएनए संश्लेषण की अनुमति देता है। पाइरोसीक्वेंसर एक ल्यूमिनेसेंट रीडआउट के आधार पर शामिल प्रत्येक आधार की मात्रा को रिकॉर्ड करता है, जिससे डीएनए संश्लेषण पर उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार के माइटोकॉन्ड्रियल एलील्स की सापेक्ष मात्रा का ठहराव होता है (चित्रा 1 बी)। ल्यूमिनेसेंस एक ल्यूसिफेरस एंजाइम द्वारा उत्पन्न होता है, जो एटीपी की उपस्थिति में प्रकाश का उत्सर्जन करता है कि एक एटीपी सल्फ्यूरिलेस प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड द्वारा जारी पाइरोफॉस्फेट से प्रत्येक निगमन घटना में डी नोवो को संश्लेषित करता है। इन दो प्रतिक्रियाओं को संक्षेप में निम्नानुसार किया जा सकता है:
1. पीपीआई (न्यूक्लियोटाइड निगमन से) + एपीएस → एटीपी + सल्फेट (एटीपी सल्फ्यूरिलेज)
2. एटीपी + लूसिफेरिन + ओ 2 → एएमपी + पीपीआई + ऑक्सीलुसिफेरिन + सीओ2 + प्रकाश (ल्यूसिफेरस)
दूसरी प्रतिक्रिया में ल्यूसिफेरस के साथ एटीपी क्रॉस-रिएक्शन के बिना पाइरोसीक्वेंसर द्वारा एडेनिन बेस का पता लगाना एक चुनौती है। हालांकि, यह डीएनए संश्लेषण के लिए एक एडेनिन एनालॉग का उपयोग करके हल किया जाता है, अर्थात् डीएटीपीएस। ल्यूसिफेरस के लिए एक आदर्श सब्सट्रेट नहीं होने के बावजूद, यह तीन अन्य न्यूक्लियोटाइड ्स की तुलना में एक मजबूत ल्यूमिनेसेंस पैदा करता है, जिसे पाइरोसीक्वेंसर द्वारा डिजिटल रूप से समायोजित किया जाता है और 0.9 के कारक पर सेट किया जाता है। इस अंतर्निहित परिवर्तनशीलता के कारण, एसएनपी स्थिति में अनुक्रमण एडेनिन से बचने का सुझाव दिया जाता है (अधिक विवरण के लिए चर्चा देखें)।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल पाइरोसीक्वेंसिंग द्वारा एमटीडीएनए हेटरोप्लाज्मी मूल्यांकन की विधि का विवरण देता है और एमटीडीएनए में एसएनपी को जीनोटाइपिंग करते समय जैविक या तकनीकी पूर्वाग्रह से बचने के लिए प्रवर्धन प्राइमरों को डिजाइन करने में आवश्यक सावधानियों की रूपरेखा तैयार करता है। उत्तरार्द्ध में प्राइमर सेट ों का डिजिटल रूप से सर्वेक्षण और चयन करना, पूर्वप्रवर्धन पीसीआर को अनुकूलित करना और अंत में, परख को अनुक्रमित और परिष्कृत करना शामिल है। दो लागू उदाहरण परख ों का प्रदर्शन किया जाता है: पहला, सबसे आम मानव रोगजनक संस्करण m.3243A>G 18 का अनुकूलन, और दूसरा, माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (MEF) कोशिकाओं की जीनोटाइपिंग जो कैम्ब्रिज 10,11,12,19,20,21,22 में मिन्ज़ुक प्रयोगशाला में विकसित प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके हेटरोप्लाज्मी स्थानांतरण से गुजरी हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल की सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू संदूषण से बचना है, खासकर जब शुरुआती सामग्री की कम मात्रा का उपयोग किया जाता है। जहां भी संभव हो नमूने तैयार करते समय यूवी हुड और फ़िल्टर किए गए पिपेट युक्तिय…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस प्रोटोकॉल के लिए उदाहरण के रूप में उपयोग किए जाने वाले एम.3243ए>जी साइब्रिड कोशिकाओं को तैयार करने और प्रदान करने के लिए सिल्विया मार्चेट और कॉन्स्टैंज़ा लैम्पर्टी (इस्टिटो न्यूरोलॉजिको “कार्लो बेस्टा”, फोंडाज़ियोन आईआरसीसीएस, मिलान) को स्वीकार करना चाहते हैं। हम इस शोध के दौरान उपयोगी चर्चा के लिए माइटोकॉन्ड्रियल जेनेटिक्स ग्रुप (एमआरसी-एमबीयू, कैम्ब्रिज विश्वविद्यालय) के सदस्यों को भी स्वीकार करना चाहते हैं। इस काम को मेडिकल रिसर्च काउंसिल यूके (MC_UU_00015/4 और MC_UU_00028/3) से कोर फंडिंग द्वारा समर्थित किया गया था। पी.ए.एन. और पी.एस.-पी. क्रमशः लिली फाउंडेशन और द चैम्प फाउंडेशन द्वारा भी समर्थित हैं।
Materials
| KOD Hot Start DNA Polymerase | Sigma-Aldrich | 71086 | |
| PyroMark Assay Design 2.0 | QIAGEN | ||
| Pyromark Q48 Absorber Strips | QIAGEN | 974912 | |
| PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48) | QIAGEN | 974022 | |
| Pyromark Q48 Autoprep | QIAGEN | 9002470 | |
| PyroMark Q48 Cartridge Set | QIAGEN | 9024321 | |
| Pyromark Q48 Disks | QIAGEN | 974901 | |
| Pyromark Q48 Magnetic beads | QIAGEN | 974203 | |
| PyroMark Q48 Software License (1) | QIAGEN | 9024325 |
Referências
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