성숙한 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 단층을 사용한 고처리량 심장 독성 스크리닝
Summary
인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포(hiPSC-CM)는 전임상 심장 독성 스크리닝을 위해 동물을 사용하는 것에 대한 대안을 제공합니다. 전임상 독성 스크리닝에서 hiPSC-CM의 광범위한 채택에 대한 한계는 세포의 미성숙하고 태아와 유사한 표현형입니다. hiPSC-CM의 견고하고 신속한 성숙을 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.
Abstract
인간 유도 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CMs)는 전임상 심장 독성 시험을 위해 동물 및 동물 세포에 대한 의존도를 대체하고 감소시키는 데 사용됩니다. 2차원 단층 형식에서 hiPSC-CM은 최적의 세포외 기질(ECM)에서 배양할 때 성인 인간 심장 근육 세포의 구조와 기능을 요약합니다. 인간 주산기 줄기세포 유래 ECM(성숙유도 세포외 기질-MECM)은 도금 후 7일 만에 hiPSC-CM의 구조, 기능 및 대사 상태를 성숙시킵니다.
성숙한 hiPSC-CM 단층은 또한 부정맥 및 심장 독성을 유발할 위험이 있는 알려진 임상적으로 관련된 약물에 예상대로 반응합니다. hiPSC-CM 단층의 성숙은 지금까지 규제 과학 및 안전성 스크리닝을 위해 이러한 귀중한 세포를 널리 채택하는 데 걸림돌이었습니다. 이 기사에서는 hiPSC-CM 전기생리학적 및 수축 기능의 도금, 성숙 및 고처리량, 기능적 표현형에 대한 검증된 방법을 제시합니다. 이러한 방법은 상업적으로 이용 가능한 정제된 심근 세포뿐만 아니라 매우 효율적인 챔버 특이적 분화 프로토콜을 사용하여 사내에서 생성된 줄기 세포 유래 심근 세포에도 적용됩니다.
고처리량 전기생리학적 기능은 전압에 민감한 염료(VSD, 방출: 488nm), 칼슘 민감성 형광단(CSF) 또는 유전적으로 암호화된 칼슘 센서(GCaMP6)를 사용하여 측정됩니다. 고처리량 광학 매핑 장치는 각 기능 매개변수의 광학 기록에 사용되며 맞춤형 전용 소프트웨어는 전기생리학적 데이터 분석에 사용됩니다. MECM 프로토콜은 양성 수축 촉진제(이소프레날린) 및 인간 에테르-고-고-고-관련 유전자(hERG) 채널 특이적 차단제를 사용하여 약물 스크리닝에 적용됩니다. 이러한 리소스를 통해 다른 연구자는 고처리량, 전임상 심장 독성 스크리닝, 심장 약물 효능 테스트 및 심혈관 연구를 위해 성숙한 hiPSC-CM을 성공적으로 활용할 수 있습니다.
Introduction
인간 유도만능줄기세포 유래 심근세포(hiPSC-CMs)는 국제적 규모로 검증되었으며, 체외 심장독성 스크리닝에 사용할 수 있다1. 고순도 hiPSC-CM은 거의 무제한으로 생성, 냉동 보존 및 해동할 수 있습니다. 다시 도금 할 때, 그들은 또한 인간의 심장 2,3을 연상시키는 리듬으로 다시 살아 움직이고 수축하기 시작합니다. 놀랍게도, 개별 hiPSC-CM은 서로 결합되어 단일 조직으로 뛰는 기능적 세포융합을 형성합니다. 오늘날, hiPSC는 일상적으로 환자의 혈액 샘플에서 추출되므로, 시험관 내 hiPSC-CM 심장독성 스크리닝 분석법을 사용하여 모든 사람을 대표할 수 있다 4,5. 이를 통해 “Clinical Trials in a Dish”를 수행할 수 있는 기회가 주어지며, 다양한 집단을 대표하는 비율이 높아진다6.
기존 동물 및 동물 세포 심장 독성 스크리닝 접근법에 비해 한 가지 중요한 이점은 hiPSC-CM이 전체 인간 게놈을 활용하고 인간 심장과 유전적 유사성을 가진 시험관 내 시스템을 제공한다는 것입니다. 이는 약물유전체학 및 개인 맞춤 의학에 특히 매력적이며, 약물 및 기타 치료법 개발에 hiPSC-CM을 사용하면 보다 정확하고 정확하며 안전한 약물 처방을 제공할 것으로 예상됩니다. 실제로, 2차원(2D) hiPSC-CM 단층 분석은 부정맥을 유발할 위험이 있는 것으로 알려진 임상적으로 사용되는 약물 패널을 사용하여 약물 심장 독성을 예측하는 것으로 입증되었습니다 1,7,8,9. hiPSC-CM의 방대한 잠재력과 약물 개발을 간소화하고 더 저렴하게 만들겠다는 약속에도 불구하고 이러한 새로운 분석법을 사용하는 것을 꺼려했습니다10,11,12.
지금까지 hiPSC-CM 스크리닝 분석의 광범위한 채택 및 수용의 주요 한계 중 하나는 미성숙하고 태아와 유사한 외관과 기능입니다. hiPSC-CM 성숙의 중요한 문제는 과학 문헌 광고 메스꺼움13,14,15,16에서 검토되고 논의되었습니다. 마찬가지로, 2D 단층의 세포외 기질(ECM) 조작 및 3D 공학 심장 조직(EHT)의 개발을 포함하여 hiPSC-CM 성숙을 촉진하기 위해 많은 접근 방식이 사용되었습니다17,18. 현재 3D EHT를 사용하면 2D 단층 기반 접근 방식에 비해 우수한 성숙도를 제공할 것이라는 믿음이 널리 퍼져 있습니다. 그러나 2D 단층은 3D EHT에 비해 셀 활용 효율이 높고 도금 성공률이 높습니다. 3D EHT는 더 많은 수의 셀을 사용하며, 종종 결과를 혼란스럽게 할 수 있는 다른 셀 유형을 포함해야 합니다. 따라서 이 기사에서는 전기적 및 기계적으로 결합된 세포의 2D 단층으로 배양된 hiPSC-CM을 성숙시키는 간단한 방법을 사용하는 데 중점을 둡니다.
ECM을 사용하여 2D 단층에서 고급 hiPSC-CM 성숙을 달성할 수 있습니다. hiPSC-CM의 2D 단층은 Engelbreth-Holm-Swarm 마우스 육종 세포(마우스 ECM)에서 분비되는 기저막 매트릭스로 코팅된 부드럽고 유연한 폴리디메틸실록산 커버슬립을 사용하여 성숙할 수 있습니다. 2016년 보고서에 따르면 이 부드러운 ECM 조건에서 배양된 hiPSC-CM은 기능적으로 성숙하여 성인 심장 값(~50cm/s)에 가까운 활동 전위 전도 속도를 나타냅니다18. 또한, 이러한 성숙한 hiPSC-CM은 과분극 휴지막 전위 및Kir2.1의 발현을 포함하여 성인 심장을 연상시키는 많은 다른 전기생리학적 특성을 나타냈습니다. 보다 최근에, 보고된 바에 따르면, 2차원 hiPSC-CM의 구조적 성숙을 촉진하는 인간 주산기 줄기세포 유래 ECM 코팅이 확인되었다19. 여기에서는 고처리량 전기생리학적 스크린에 사용하기 위해 구조적으로 성숙한 2D hiPSC-CM 단층에 사용하기 쉬운 방법을 제시합니다. 또한 전압에 민감한 염료(VSD)와 칼슘에 민감한 프로브 및 단백질을 사용하여 2D hiPSC-CM 단층 전기생리학적 기능의 자동 획득 및 분석을 위한 광학 매핑 기기의 검증을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
hiPSC-CM을 사용한 체외 심장 독성 스크리닝에는 여러 가지 접근 방식이 있습니다. hiPSC-CM의 사용에 관한 최근의 “모범 사례” 논문은 다양한 체외 분석법, 1차 판독값, 그리고 중요하게는 인간 심장 전기생리학적 기능을 정량화하기 위한 각 분석의 세분성을 제시했다20. 멤브레인 피어싱 전극을 사용하는 것 외에도 인간의 심장 전기생리학적 기능에 대한 가장 직접적인 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 NIH 보조금 HL148068-04 및 R44ES027703-02(TJH)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 0.25% Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) | Millipore Sigma | A3294 | |
| 2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) | Millipore Sigma | H4034 | |
| AdGCaMP6m | Vector biolabs | 1909 | |
| Albumin human | Sigma | A9731-1G | |
| alpha actinin antibody | ThermoFisher | MA1-22863 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Blebbistatin | Sigma | B0560 | |
| CalBryte 520AM | AAT Bioquest | 20650 | |
| CELLvo MatrixPlus 96wp | StemBiosys | N/A | https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus |
| CHIR99021 | LC Laboratories | c-6556 | |
| Clear Assay medium (fluorobrite) | ThermoFisher | A1896701 | For adenovirus transduction |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135-500ML | |
| FluoVolt | ThermoFisher | F10488 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| iCell CM maintenance media | FUJIFILM/Cellular Dynamics | M1003 | |
| iCell2 CMs | FUJIFILM | 1434 | |
| Incucyte Zoom | Sartorius | ||
| iPS DF19-9-11T.H | WiCell | ||
| Isoproterenol | MilliporeSigma | CAS-51-30-9 | |
| IWP4 | Tocris | 5214 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960-5g | |
| L-glutamine | Gibco | A2916801 | |
| LS columns | Miltenyii Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) | Miltenyii Biotec | 130-091-221 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| MitoTracker Red | ThermoFisher | M7512 | |
| Nautilus HTS Optical Mapping | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Nikon A1R Confocal Microscope | Nikon | ||
| nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| pre-separation filter | Miltenyii Biotec | 130-041-407 | |
| PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human | Miltenyii Biotec | 130-110-188 | |
| Pulse | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Quadro MACS separator (Magnet) | Miltenyii Biotec | 130-091-051 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) | Gibco | 22400-089 | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyii Biotec | 130-107-086 | |
| TnI antibody (pan TnI) | Millipore Sigma | MAB1691 | |
| Versene (ethylenediaminetetraacetic acid – EDTA solution) | Gibco | 15040-066 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |
Referências
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