Triagem de cardiotoxicidade de alto rendimento usando monocamadas de cardiomiócitos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos maduros
Summary
Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) oferecem uma alternativa ao uso de animais para triagem pré-clínica de cardiotoxicidade. Uma limitação à adoção generalizada de hiPSC-CMs na triagem pré-clínica de toxicidade é o fenótipo imaturo e semelhante ao fetal das células. São apresentados protocolos para maturação robusta e rápida de hiPSC-CMs.
Abstract
Os cardiomiócitos derivados de células-tronco induzidas humanas (hiPSC-CMs) são usados para substituir e reduzir a dependência de animais e células animais para testes pré-clínicos de cardiotoxicidade. Em formatos bidimensionais de monocamada, os hiPSC-CMs recapitulam a estrutura e a função das células musculares cardíacas humanas adultas quando cultivadas em uma matriz extracelular (MEC) ótima. Uma MEC derivada de células-tronco perinatais humanas (matriz extracelular indutora de maturação-MECM) amadurece a estrutura, a função e o estado metabólico do hiPSC-CM em 7 dias após o plaqueamento.
As monocamadas maduras de hiPSC-CM também respondem, como esperado, a medicamentos clinicamente relevantes, com risco conhecido de causar arritmias e cardiotoxicidade. A maturação das monocamadas hiPSC-CM foi um obstáculo à adoção generalizada dessas células valiosas para a ciência regulatória e triagem de segurança, até agora. Este artigo apresenta métodos validados para o plaqueamento, maturação e fenotipagem funcional de alto rendimento da função eletrofisiológica e contrátil hiPSC-CM. Esses métodos aplicam-se aos cardiomiócitos purificados comercialmente disponíveis, bem como aos cardiomiócitos derivados de células-tronco gerados internamente usando protocolos de diferenciação altamente eficientes e específicos da câmara.
A função eletrofisiológica de alto rendimento é medida usando corantes sensíveis à voltagem (VSDs; emissão: 488 nm), fluoróforos sensíveis ao cálcio (CSFs) ou sensores de cálcio codificados geneticamente (GCaMP6). Um dispositivo de mapeamento óptico de alto rendimento é usado para gravações ópticas de cada parâmetro funcional, e um software dedicado personalizado é usado para análise de dados eletrofisiológicos. Os protocolos MECM são aplicados para triagem de medicamentos usando um inotrópico positivo (isoprenaline) e bloqueadores de canal específicos do gene humano relacionado ao Ether-a-go-go (hERG). Esses recursos permitirão que outros pesquisadores utilizem com sucesso hiPSC-CMs maduros para triagem pré-clínica de cardiotoxicidade de alto rendimento, testes de eficácia de medicamentos cardíacos e pesquisa cardiovascular.
Introduction
Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (MC-hiPSC) foram validados em escala internacional e estão disponíveis para triagem de cardiotoxicidade in vitro 1. HiPSC-CMs altamente puros podem ser gerados em números virtualmente ilimitados, criopreservados e descongelados. Ao serem replaqueados, eles também reanimam e começam a se contrair com um ritmo que lembra o coração humano 2,3. Notavelmente, os hiPSC-CMs individuais se acoplam uns aos outros e formam sincícios funcionais que batem como um único tecido. Atualmente, as hiPSCs são rotineiramente derivadas de amostras de sangue de pacientes, de modo que qualquer pessoa pode ser representada usando ensaios in vitro de triagem de cardiotoxicidade com hiPSC-CM 4,5. Isso cria a oportunidade de realizar “Ensaios Clínicos em um Prato”, com representação significativa de diversas populações6.
Uma vantagem crítica sobre as abordagens existentes de triagem de cardiotoxicidade animal e de células animais é que os hiPSC-CMs utilizam o genoma humano completo e oferecem um sistema in vitro com semelhanças genéticas com o coração humano. Isso é especialmente atraente para farmacogenômica e medicina personalizada – o uso de hiPSC-CMs para o desenvolvimento de medicamentos e outras terapias é previsto para fornecer prescrições de medicamentos mais precisas, precisas e seguras. De fato, ensaios bidimensionais (2D) de monocamada de hiPSC-CM provaram ser preditivos de cardiotoxicidade medicamentosa, utilizando um painel de medicamentos de uso clínico com risco conhecido de causar arritmias 1,7,8,9. Apesar do grande potencial dos MC-hiPSC e da promessa de agilizar e baratear o desenvolvimento de fármacos, tem havido uma relutância em utilizar esses novos ensaios10,11,12.
Até agora, uma grande limitação da ampla adoção e aceitação dos ensaios de rastreamento hiPSC-CM é sua aparência imatura e fetal, bem como sua função. A questão crítica da maturação da hiPSC-CM tem sido revista e debatida na literatura científica ad nauseum13,14,15,16. Da mesma forma, muitas abordagens têm sido empregadas para promover a maturação da hiPSC-CM, incluindo manipulações da matriz extracelular (MEC) em monocamadas 2D e o desenvolvimento de tecidos cardíacos (EHTs) projetados em 3D17,18. No momento, há uma crença amplamente difundida de que o uso de EHTs 3D proporcionará maturação superior em relação às abordagens baseadas em monocamadas 2D. No entanto, as monocamadas 2D proporcionam uma maior eficiência de utilização celular e maior sucesso no revestimento em comparação com os EHTs 3D; Os EHTs 3D utilizam um número maior de células e, muitas vezes, requerem a inclusão de outros tipos de células que podem confundir os resultados. Portanto, neste artigo, o foco está no uso de um método simples para amadurecer hiPSC-CMs cultivadas como monocamadas 2D de células acopladas elétrica e mecanicamente.
A maturação avançada do hiPSC-CM pode ser obtida em monocamadas 2D usando um ECM. As monocamadas 2D de hiPSC-CMs podem ser amadurecidas usando uma lamínula macia e flexível de polidimetilsiloxano, revestida com matriz de membrana basal secretada por uma célula de sarcoma de camundongo Engelbreth-Holm-Swarm (ECM de camundongo). Em 2016, relatos mostraram que os MC-hiPSC cultivados nessa condição de MEC mole amadureceram funcionalmente, exibindo velocidades de condução do potencial de ação próximas aos valores do coração adulto (~50 cm/s)18. Além disso, esses hiPSC-CMs maduros exibiram muitas outras características eletrofisiológicas que lembram o coração adulto, incluindo potencial de membrana de repouso hiperpolarizado e expressão de Kir2.1. Mais recentemente, relatos identificaram um revestimento de MEC derivado de células-tronco perinatais humanas que promove a maturação estrutural de HIPSC-CMs 2D19. Aqui, métodos fáceis de usar são apresentados para monocamadas hiPSC-CM 2D estruturalmente maduras para uso em telas eletrofisiológicas de alto rendimento. Além disso, fornecemos a validação de um instrumento de mapeamento óptico para a aquisição e análise automatizada da função eletrofisiológica da monocamada hiPSC-CM 2D, usando corantes sensíveis à voltagem (VSDs) e sondas e proteínas sensíveis ao cálcio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existem várias abordagens diferentes para a triagem de cardiotoxicidade in vitro usando hiPSC-CMs. Um recente artigo de “Melhores Práticas” sobre o uso de hiPSC-CMs apresentou os vários ensaios in vitro , suas leituras primárias e, principalmente, a granularidade de cada ensaio para quantificar a função eletrofisiológica cardíaca humana20. Além de usar eletrodos perfurantes de membrana, a medida mais direta da função eletrofisiológica cardíaca humana é fornecida pel…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do NIH HL148068-04 e R44ES027703-02 (TJH).
Materials
| 0.25% Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) | Millipore Sigma | A3294 | |
| 2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) | Millipore Sigma | H4034 | |
| AdGCaMP6m | Vector biolabs | 1909 | |
| Albumin human | Sigma | A9731-1G | |
| alpha actinin antibody | ThermoFisher | MA1-22863 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Blebbistatin | Sigma | B0560 | |
| CalBryte 520AM | AAT Bioquest | 20650 | |
| CELLvo MatrixPlus 96wp | StemBiosys | N/A | https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus |
| CHIR99021 | LC Laboratories | c-6556 | |
| Clear Assay medium (fluorobrite) | ThermoFisher | A1896701 | For adenovirus transduction |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135-500ML | |
| FluoVolt | ThermoFisher | F10488 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| iCell CM maintenance media | FUJIFILM/Cellular Dynamics | M1003 | |
| iCell2 CMs | FUJIFILM | 1434 | |
| Incucyte Zoom | Sartorius | ||
| iPS DF19-9-11T.H | WiCell | ||
| Isoproterenol | MilliporeSigma | CAS-51-30-9 | |
| IWP4 | Tocris | 5214 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960-5g | |
| L-glutamine | Gibco | A2916801 | |
| LS columns | Miltenyii Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) | Miltenyii Biotec | 130-091-221 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| MitoTracker Red | ThermoFisher | M7512 | |
| Nautilus HTS Optical Mapping | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Nikon A1R Confocal Microscope | Nikon | ||
| nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| pre-separation filter | Miltenyii Biotec | 130-041-407 | |
| PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human | Miltenyii Biotec | 130-110-188 | |
| Pulse | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Quadro MACS separator (Magnet) | Miltenyii Biotec | 130-091-051 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) | Gibco | 22400-089 | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyii Biotec | 130-107-086 | |
| TnI antibody (pan TnI) | Millipore Sigma | MAB1691 | |
| Versene (ethylenediaminetetraacetic acid – EDTA solution) | Gibco | 15040-066 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |
Referências
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