Method Article

Determinação da Cinética de Ativação In Vitro e Celular para Aptamers de RNA Fluorogênico

DOI:

10.3791/64367

⸱

August 9th, 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry and Henry Eyring Center for Cell & Genome Science, University of Utah

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo apresenta dois métodos para determinar a cinética dos aptâmeros de RNA fluorogênico Espinafre2 e Brócolis. O primeiro método descreve como medir a cinética do aptâmero fluorogênico in vitro com um leitor de placas, enquanto o segundo método detalha a medição da cinética do aptâmero fluorogênico nas células por citometria de fluxo.

Abstract

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Aptâmeros de RNA fluorogênicos têm sido aplicados em células vivas para marcar e visualizar RNAs, relatar a expressão gênica e ativar biossensores fluorescentes que detectam níveis de metabólitos e moléculas de sinalização. Para estudar as mudanças dinâmicas em cada um desses sistemas, é desejável obter medições em tempo real, mas a precisão das medições depende da cinética da reação fluorogênica ser mais rápida do que a frequência de amostragem. Aqui, descrevemos métodos para determinar a cinética de ativação in vitro e celular para aptâmeros de RNA fluorogênicos usando um leitor de placas equipado com um injetor de amostra e um citômetro de fluxo, respectivamente. Mostramos que a cinética in vitro para a ativação por fluorescência dos aptâmeros Espinafre2 e Brócolis pode ser modelada como reações de associação bifásica e tem diferentes constantes de taxa de fase rápida de 0,56 s−1 e 0,35 s−1, respectivamente. Além disso, mostramos que a cinética celular para a ativação por fluorescência do Espinafre2 em Escherichia coli, que é ainda mais limitada pela difusão do corante nas bactérias Gram-negativas, ainda é suficientemente rápida para permitir uma frequência de amostragem precisa na escala de tempo minuto. Esses métodos para analisar a cinética de ativação por fluorescência são aplicáveis a outros aptâmeros de RNA fluorogênicos que foram desenvolvidos.

Introduction

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Reações fluorogênicas são reações químicas que geram um sinal de fluorescência. Os aptâmeros de RNA fluorogênicos normalmente desempenham essa função ligando um corante de molécula pequena para aumentar seu rendimento quântico de fluorescência (Figura 1A)1. Diferentes sistemas de aptâmeros de RNA fluorogênicos foram desenvolvidos e consistem em sequências específicas de aptâmeros de RNA e os ligantes corantes correspondentes1. Aptâmeros de RNA fluorogênicos têm sido anexados a transcritos de RNA como etiquetas fluorescentes que permitem a imagem de células vivas de mRNAs e<....

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Protocol

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1. Experimento de cinética in vitro

  1. Preparação de moldes de ADN por PCR
    1. Configurar reação(ões) de PCR: Para preparar reações de PCR, combine os seguintes reagentes em um tubo de PCR de paredes finas:
      33 μL de água duplamente destilada (ddH2O)
      10 μL de tampão 5x para DNA polimerase de alta fidelidade
      5 μL de 2 mM de cada trifosfato desoxirribonucleosídeo (dNTP)
      0,5 μL de 40 μM de primer para a frente
      0,5 μL de primer reverso de 40 μM
      0,5 μL (10-100 ng) de molde de DNA (apenas para Spinach2 PCR; Sobreposição de primers de brócolis)
      0,5 μL de DNA polimerase de alta fidelidade (adicionar por último....

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Results

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Cinética in vitro
As sequências dos moldes e primers de DNA, que são adquiridos como oligonucleotídeos sintéticos, são mostradas na Tabela 2, e as receitas de reagentes são mostradas no Arquivo Suplementar 1. A amplificação por PCR é usada para aumentar a quantidade de molde de DNA com o promotor T7, que é necessário para a reação subsequente de transcrição in vitro (IVT). Além disso, a amplificação por PCR pode ser usada para dois .......

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Discussion

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Para o experimento de cinética in vitro , o mesmo protocolo geral pode ser modificado para medir a cinética in vitro de um biossensor fluorescente baseado em RNA contendo um domínio de ligação ao ligante e de ligação ao fluoróforo8. Neste caso, o RNA deve ser incubado com o fluoróforo antes das medições após a injeção do ligante, a fim de obter cinética de resposta do ligante. Se for observada alta variabilidade entre as replicações, pode-se solucionar problemas verificando se ca.......

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Disclosures

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgements

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Este trabalho foi apoiado pelas seguintes subvenções à MCH: NSF-BSF 1815508 e NIH R01 GM124589. O MRM foi parcialmente apoiado pela bolsa de treinamento NIH T32 GM122740.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseThermo Fischer ScientificBP160500
Equipamento de eletroforese em gel de agaroseThermo Fischer ScientificB1A-BP
Alpha D-(+)-lactose monohidratadaThermo Fischer Scientific18-600-440
Âmbar Tubos de microcentrífuga de 1,5 mLThermo Fischer Scientific22431021
Persulfato de amônio (APS)Sigma-AldrichA3678
Sulfato de amônio ((NH4)2SO4)Sigma-AldrichA4418
Attune NxT Citômetro de fluxoThermo Fischer ScientificA24861
Attune 1x Fluido de focoThermo Fischer ScientificA24904
Solução de desligamento de sintoniaThermo Fischer ScientificA24975
Attune Performance Tracking BeadsThermo Fischer Scientific4449754
Solução de Lavagem AttuneThermo Fischer Scientific  J24974
Ácido bóricoSigma-AldrichB6768
Azul de bromofenolSigma-AldrichB0126
Sal dissódico de carbenicilinaSigma-AldrichC3416
Alvejante de cloroAmazonB07J6FJR8D
Corning Costar placa de 96 poçosDaigger ScientificEF86610A
Tubos de Cultura, 12 mm x 75 mm, 5 mL com tampa de posição dupla anexadaGlobe Scientific05-402-31
DFHBISigma-AldrichSML1627
DFHBI-1TSigma-AldrichSML2697
D-Glucose (anidra)Acros OrganicsAC410955000
Dimetil sulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Ditiotreitol (DTT)Sigma-AldrichDTT-RO
DNA corante de carregamento de DNANew England BiolabsB7025S
DNA LoBind Tubes (2.0 mL)Eppendorf22431048
dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTPNew England BiolabsN0446S
EDTA, pH 8.0Gibco, Life TechnologiesAM9260G
Etanol (EtOH)Sigma-AldrichE7023
Pontas de micropipetador com ponta de filtroThermo Fischer ScientificAM12635, AM12648, AM12655, AM12665
Software FlowJo BDBiosciencesN/AFlowJo v10 Software
Leitor de placas fluorescentes com controlo de aquecimentoVWR10014-924
Fonte de alimentação para eletroforese em gelThermo Fischer ScientificEC3000XL2
GlicerolSigma-AldrichG5516
Glicogênio AM95010Thermo Fischer ScientificAM95010
GraphPad PrismDotmaticsN/ASoftware de análise do Academic Group License 
Bloco de calor Thomas Scientific1159Z11
HEPESSigma-AldrichH-4034
Pirofosfatase inorgânicaSigma-AldrichI1643-500UN
Escada de DNA de baixo peso molecularNew England BiolabsN3233LFornecido com frasco gratuito de Corante de Carregamento de Gel, Roxo (6x), sem SDS (NEB #B7025).
Cloreto de magnésio hexahidratado (MgCl2)Sigma-AldrichM2670
Sulfato de magnésio (MgSO4)Fisher ScientificMFCD00011110
(1,5 mL)Microcentrífuga Eppendorf22363204
com controle de temperaturaMarshall ScientificEP-5415R
MicropipetadoresGilsonFA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M Ponteiras
de micropipetadorSigma-AldrichZ369004, AXYT200CR, AXYT1000CR
Millipore com unidade BioPakSigma-AldrichCDUFBI001, ZRQSVR3WW
Ponteiras de pipeta de micropipetador estreitasDOT ScientificRN005R-LRS
PBS, 10xThermo Fischer Kit dede PCR de BP39920
Qiagen28181
Primers e modelos de PCRTecnologias
Termociclador de PCR para tubos de PCR de paredes finas TermocicladorBio-Rad1851148
para tubos de 0,5 mLTechne5PRIME/C
pET31b-T7-Spinach2 PlasmidAddgenePlasmídeo #79783
Phusion Polimerase DNA de Alta Fidelidade M0530LNew England Biolabsé fornecida com 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer e soluções de MgCl2 e DMSO.
Pente de gel de eletroforese em gel de poliacrilamida, C.B.S. ScientificC.B.S. ScientificVGC-1508
Equipamento de eletroforese em gel de poliacrilamidaC.B.S. ScientificASG-250
Cloreto de potássio (KCl)Sigma-AldrichP9333
Fosfato de potássio monobásicoSigma-AldrichP5655
Lâminas de barbearGenesee Scientific38-101
rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTPNew England BiolabsN0450L
SDSSigma-AldrichL3771
Fonte de luz UV de onda curtaThermo Fischer Scientific11758221
Carbonato de sódio (Na2CO3)Sigma-AldrichS7795
Sódio cloreto (NaCl)Sigma-AldrichS7653
Hidróxido de sódio (NaOH)Sigma-AldrichS8045
Fosfato de sódio dibásico, anidroThermo Fischer ScientificS375-500
SoftMax ProMolecular DevicesN/ASoftMax Pro 6.5.1 (software de leitura de placas) obtido através do Grupo Acadêmico
Licença Unidades de filtro estéreisThermo Fischer Scientific09-741-88
SacaroseSigma-AldrichS0389
SYBR Mancha segura de gel de DNAThermo Fischer ScientificS33102
Tampão TAE para eletroforese em gel de agaroseThermo Fischer ScientificAM9869
Tetrametiletilenodiamina (TEMED)Sigma-AldrichT9281
BaseTrisSigma-AldrichTRIS-RO
Triptona (granulado)Thermo Fischer ScientificM0251S
T7 RNA polimeraseNew England BiolabsM0251S
Ureia-PAGE Gel system DiagnosticsEC-833
Sigma-Aldrich1.05789.0001
Espectrofotômetro UV/VisThermo Fischer ScientificND-8000-GL
Misturador de vórticeThermo Fischer Scientific2215415
Xileno cianolExtrato de levedura Sigma-AldrichX4126
(granulado)Thermo Fischer ScientificBP9727-2
Tubos de microcentrífuga Filtro de água limpeza científicointegradas de DNA de PCR A compra da enzima de alta fidelidade Phusion da Placa TLC fluorescente UV National

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Su, Y., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs. Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).
  2. Zhang, J., et al. Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial ....

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