Vi præsenterer en trinvis tilgang til at identificere og løse de mest almindelige problemer forbundet med atomkraftmikroskopimikroindrykninger. Vi eksemplificerer de nye problemer på indfødte menneskelige ledbruskeksplanter, der er kendetegnet ved forskellige grader af slidgigtdrevet degeneration.
Uden tvivl er atomkraftmikroskopi (AFM) i øjeblikket en af de mest kraftfulde og nyttige teknikker til at vurdere mikro- og endda nano-signaler på det biologiske område. Men som med enhver anden mikroskopisk tilgang kan der opstå metodologiske udfordringer. Især kan egenskaberne ved prøven, prøveforberedelsen, instrumenttypen og indrykningssonden føre til uønskede artefakter. I denne protokol eksemplificerer vi disse nye problemer på sunde såvel som osteoartritiske ledbruskeksplanter. Til dette formål viser vi først via en trinvis tilgang, hvordan man genererer, klassificerer og visuelt klassificerer ex vivo ledbruskskiver i henhold til forskellige stadier af degeneration ved hjælp af stor 2D-mosaikfluorescensbilleddannelse af hele vævseksplanterne. Den største styrke ved ex vivo-modellen er, at den omfatter alderen, hjemmehørende, menneskelig brusk, der gør det muligt at undersøge slidgigtrelaterede ændringer fra tidlig debut til progression. Derudover præsenteres også almindelige faldgruber i vævsforberedelse samt selve AFM-proceduren sammen med den efterfølgende dataanalyse. Vi viser, hvordan grundlæggende, men afgørende trin såsom prøveforberedelse og -behandling, topografiske prøveegenskaber forårsaget af avanceret degeneration og interaktion mellem prøver og spidser kan påvirke dataindsamling. Vi undersøger også de mest almindelige problemer i AFM og beskriver, hvor det er muligt, hvordan man kan overvinde dem. Kendskab til disse begrænsninger er af største betydning for korrekt dataindsamling, fortolkning og i sidste ende indlejring af resultater i en bred videnskabelig sammenhæng.
På grund af den stadigt mindre størrelse af elektroniske enheder og systemer har den hurtige udvikling af mikro- og nanobaseret teknologi og udstyr fået fart. En sådan enhed er atomkraftmikroskopi (AFM), som kan scanne biologiske overflader og hente topografisk eller biomekanisk information på både nano- og mikrometerskala 1,2. Blandt dets store funktioner kan dette værktøj betjenes som en mikro- såvel som en nano-indenter for at få information om de mekaniske egenskaber ved forskellige biologiske systemer 3,4,5,6. Dataene indsamles ved fysisk kontakt med overfladen gennem en mekanisk sonde, som kan være så lille som ca. 1 nm ved dens spids7. Den resulterende deformation af prøven vises derefter baseret på fordybningsdybden af udkragningsspidsen og den kraft, der påføres prøven8.
Slidgigt (OA) er en langsigtet degenerativ kronisk sygdom karakteriseret ved forringelse af ledbrusk i leddene og omgivende væv, hvilket kan føre til fuldstændig eksponering af knogleoverfladerne. OA’s byrde er betydelig; I øjeblikket lider halvdelen af alle kvinder og en tredjedel af alle mænd i alderen 65 år og derover af OA9. Traumer, fedme og den deraf følgende ændrede biomekanik i leddet10 bestemmer ledbruskdegenerationen, som ses som et fælles slutresultat. Den banebrydende undersøgelse af Ganz et al. postulerede, at de tidlige trin i OA-processen kan involvere de biomekaniske egenskaber af brusk11, og siden da har forskere bekræftet denne hypotese12. Ligeledes er det generelt accepteret, at vævets biomekaniske egenskaber er funktionelt orkestreret af den ultrastrukturelle organisation såvel som celle-celle og celle-matrix krydstale. Eventuelle ændringer kan dramatisk påvirke den samlede vævsbiomekaniske funktion13. Til dato er OA-diagnosen klinisk og er baseret på almindelig filmradiografi14. Denne tilgang er tosidet: For det første gør manglen på en defineret degenerativ afskæringstærskel til formulering af diagnosen OA tilstanden vanskelig at kvantificere, og for det andet mangler billeddannelsesmetoder følsomhed og standardisering og kan ikke detektere lokaliserede bruskskader15,16,17. Til dette formål har vurderingen af bruskens mekaniske egenskaber den afgørende fordel, at den beskriver en parameter, der ændrer sig i løbet af OA uanset sygdommens ætiologi og har en direkte indflydelse på vævsfunktionaliteten på et meget tidligt stadium. Indrykningsinstrumenter måler den kraft, hvormed vævet modstår fordybningen. Det er faktisk ikke noget nyt begreb. De tidligste undersøgelser går tilbage til 1980’erne og 1990’erne. I denne periode antydede talrige undersøgelser, at indrykningsinstrumenter designet til artroskopiske målinger af ledbrusk kunne være velegnede til at detektere degenerative ændringer i brusk. Selv for 30 år siden var nogle undersøgelser i stand til at demonstrere, at indrykningsinstrumenter var i stand til at detektere in vivo-ændringer i bruskoverfladen under vævsdegeneration ved at udføre trykstivhedsmålinger under artroskopi18,19,20.
AFM-indrykning (AFM-IT) af ledbrusk giver information om vævets afgørende mekaniske egenskab, nemlig stivhed. Dette er en mekanisk parameter, der beskriver forholdet mellem en påført, ikke-destruktiv belastning og den resulterende deformation af det indrykkede vævsområde21. AFM-IT har vist sig at være i stand til at kvantificere aldersafhængige modifikationer i stivhed i makroskopisk upåvirkede kollagennetværk og således skelne mellem de patologiske ændringer forbundet med OA-debut (grad 0 på Outerbridge-skalaen i ledbrusk)22. Vi har tidligere vist, at AFM-IT’er, baseret på rumlig chondrocytorganisation som en billedbaseret biomarkør for tidlig bruskdegeneration, giver mulighed for ikke kun at kvantificere, men også faktisk identificere de tidligste degenerative mekaniske ændringer. Disse resultater er allerede blevet bekræftet af andre23,24. Derfor fungerer AFM-IT som et interessant værktøj til at diagnosticere og identificere tidlige degenerative ændringer. Disse ændringer kan allerede måles på cellulært niveau, hvilket omformer forståelsen af OA-patofysiologisk proces.
I denne protokol demonstrerer vi en komplet histologisk og biomekanisk klassificeringsprocedure for ledbruskeksplanter, fra native bruskeksplantatforberedelse til AFM-dataindsamling og -behandling. Gennem en trinvis tilgang viser vi, hvordan man genererer, klassificerer og visuelt klassificerer ledbruskvæv i henhold til forskellige stadier af degeneration ved hjælp af 2D stor mosaikbilleddannelse efterfulgt af mikro-AFM-fordybninger.
Selvom AFM-IT i øjeblikket er et af de mest følsomme værktøjer til måling af biomekaniske ændringer i brusk7, har det som enhver anden instrumentel teknik begrænsninger og praktiske særegenheder25, der kan føre til fejlagtig dataindsamling. Til dette formål undersøger vi de mest almindelige problemer, der opstår under AFM-målinger af bruskeksanlæggene, og beskriver, hvor det er muligt, hvordan man minimerer eller overvinder dem. Disse omfatter topografiske aspekter af prøverne og vanskelighederne med at stabilisere dem i et AFM-kompatibelt miljø, fysiske egenskaber ved vævets overflade og de deraf følgende vanskeligheder med at udføre AFM-målinger på sådanne overflader. Eksempler på fejlagtige kraftafstandskurver præsenteres også, hvilket understreger de forhold, der kan forårsage dem. Yderligere begrænsninger, der er forbundet med cantileverspidsens geometri og brugen af Hertz-modellen til dataanalysen, diskuteres også.
Som en progressiv og multifaktoriel sygdom udløser OA strukturelle og funktionelle ændringer i ledbrusk. I løbet af OA ledsages forringelser i mekaniske egenskaber af strukturelle og biokemiske ændringer på overfladen af ledbrusk27,31. De tidligste patologiske hændelser, der forekommer i OA, er proteoglycanudtømning kombineret med kollagennetværksforstyrrelse32,33,34</…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker ortopædkirurgerne fra ortopædkirurgisk afdeling på universitetshospitalet i Tuebingen for at have leveret vævsprøverne.
Amphotericin B | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1397-89-3 | |
Atomic force microscop (AFM) head | CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | JPK00518 | |
Biocompatible sample glue | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | H000033 | |
Calcein AM | Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA | 14948 | Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging |
Cantilever | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | SAA-SPH-5UM | Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm, geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius |
Cartilage ctting device | Self-made | n/a | Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm |
CDD camera integrated in the AFM | The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany | DFK 31BF03 | |
CDD camera integrated in the fluorescence microscope | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | DFC3000G | |
Cryotome | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | CM3050S | |
Data Processing Software for the AFM | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | n/a | Version 5.0.86, can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com |
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
Fluorescence Microscope (Leica DMi8) | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | 11889113 | |
Glass block cantiliver holder | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | SP-90-05 | Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker). |
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | F1315 | |
Microscope glass slides | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | CLS294775X50 | |
Mounting medium With DAPI | ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany | 50011 | Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs side view imaging |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4333 | |
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater) | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
Scalpel | Feather Medical Products, Osaka, Japan | 2023-01 | |
Silicone Skirt | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | n/a | Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent medium condensation in the AFM head. |
Statistical program – SPSS | IBM, Armonk, New York, USA | SPSS Statistics 22 | Vesion 280.0.0.0 (190) |
Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 | Water-soluble embedding medium |