Håndtering af praktiske spørgsmål i atomkraftmikroskopibaseret mikroindrykning på humane ledbruskeksplanter

Summary

Vi præsenterer en trinvis tilgang til at identificere og løse de mest almindelige problemer forbundet med atomkraftmikroskopimikroindrykninger. Vi eksemplificerer de nye problemer på indfødte menneskelige ledbruskeksplanter, der er kendetegnet ved forskellige grader af slidgigtdrevet degeneration.

Abstract

Uden tvivl er atomkraftmikroskopi (AFM) i øjeblikket en af de mest kraftfulde og nyttige teknikker til at vurdere mikro- og endda nano-signaler på det biologiske område. Men som med enhver anden mikroskopisk tilgang kan der opstå metodologiske udfordringer. Især kan egenskaberne ved prøven, prøveforberedelsen, instrumenttypen og indrykningssonden føre til uønskede artefakter. I denne protokol eksemplificerer vi disse nye problemer på sunde såvel som osteoartritiske ledbruskeksplanter. Til dette formål viser vi først via en trinvis tilgang, hvordan man genererer, klassificerer og visuelt klassificerer ex vivo ledbruskskiver i henhold til forskellige stadier af degeneration ved hjælp af stor 2D-mosaikfluorescensbilleddannelse af hele vævseksplanterne. Den største styrke ved ex vivo-modellen er, at den omfatter alderen, hjemmehørende, menneskelig brusk, der gør det muligt at undersøge slidgigtrelaterede ændringer fra tidlig debut til progression. Derudover præsenteres også almindelige faldgruber i vævsforberedelse samt selve AFM-proceduren sammen med den efterfølgende dataanalyse. Vi viser, hvordan grundlæggende, men afgørende trin såsom prøveforberedelse og -behandling, topografiske prøveegenskaber forårsaget af avanceret degeneration og interaktion mellem prøver og spidser kan påvirke dataindsamling. Vi undersøger også de mest almindelige problemer i AFM og beskriver, hvor det er muligt, hvordan man kan overvinde dem. Kendskab til disse begrænsninger er af største betydning for korrekt dataindsamling, fortolkning og i sidste ende indlejring af resultater i en bred videnskabelig sammenhæng.

Introduction

På grund af den stadigt mindre størrelse af elektroniske enheder og systemer har den hurtige udvikling af mikro- og nanobaseret teknologi og udstyr fået fart. En sådan enhed er atomkraftmikroskopi (AFM), som kan scanne biologiske overflader og hente topografisk eller biomekanisk information på både nano- og mikrometerskala ^1,2. Blandt dets store funktioner kan dette værktøj betjenes som en mikro- såvel som en nano-indenter for at få information om de mekaniske egenskaber ved forskellige biologiske systemer 3,4,5,6. Dataene indsamles ved fysisk kontakt med overfladen gennem en mekanisk sonde, som kan være så lille som ca. 1 nm ved dens spids⁷. Den resulterende deformation af prøven vises derefter baseret på fordybningsdybden af udkragningsspidsen og den kraft, der påføres prøven⁸.

Slidgigt (OA) er en langsigtet degenerativ kronisk sygdom karakteriseret ved forringelse af ledbrusk i leddene og omgivende væv, hvilket kan føre til fuldstændig eksponering af knogleoverfladerne. OA’s byrde er betydelig; I øjeblikket lider halvdelen af alle kvinder og en tredjedel af alle mænd i alderen 65 år og derover af OA⁹. Traumer, fedme og den deraf følgende ændrede biomekanik i leddet¹⁰ bestemmer ledbruskdegenerationen, som ses som et fælles slutresultat. Den banebrydende undersøgelse af Ganz et al. postulerede, at de tidlige trin i OA-processen kan involvere de biomekaniske egenskaber af brusk¹¹, og siden da har forskere bekræftet denne hypotese¹². Ligeledes er det generelt accepteret, at vævets biomekaniske egenskaber er funktionelt orkestreret af den ultrastrukturelle organisation såvel som celle-celle og celle-matrix krydstale. Eventuelle ændringer kan dramatisk påvirke den samlede vævsbiomekaniske funktion¹³. Til dato er OA-diagnosen klinisk og er baseret på almindelig filmradiografi¹⁴. Denne tilgang er tosidet: For det første gør manglen på en defineret degenerativ afskæringstærskel til formulering af diagnosen OA tilstanden vanskelig at kvantificere, og for det andet mangler billeddannelsesmetoder følsomhed og standardisering og kan ikke detektere lokaliserede bruskskader^15,16,17. Til dette formål har vurderingen af bruskens mekaniske egenskaber den afgørende fordel, at den beskriver en parameter, der ændrer sig i løbet af OA uanset sygdommens ætiologi og har en direkte indflydelse på vævsfunktionaliteten på et meget tidligt stadium. Indrykningsinstrumenter måler den kraft, hvormed vævet modstår fordybningen. Det er faktisk ikke noget nyt begreb. De tidligste undersøgelser går tilbage til 1980’erne og 1990’erne. I denne periode antydede talrige undersøgelser, at indrykningsinstrumenter designet til artroskopiske målinger af ledbrusk kunne være velegnede til at detektere degenerative ændringer i brusk. Selv for 30 år siden var nogle undersøgelser i stand til at demonstrere, at indrykningsinstrumenter var i stand til at detektere in vivo-ændringer i bruskoverfladen under vævsdegeneration ved at udføre trykstivhedsmålinger under artroskopi^18,19,20.

AFM-indrykning (AFM-IT) af ledbrusk giver information om vævets afgørende mekaniske egenskab, nemlig stivhed. Dette er en mekanisk parameter, der beskriver forholdet mellem en påført, ikke-destruktiv belastning og den resulterende deformation af det indrykkede vævsområde²¹. AFM-IT har vist sig at være i stand til at kvantificere aldersafhængige modifikationer i stivhed i makroskopisk upåvirkede kollagennetværk og således skelne mellem de patologiske ændringer forbundet med OA-debut (grad 0 på Outerbridge-skalaen i ledbrusk)²². Vi har tidligere vist, at AFM-IT’er, baseret på rumlig chondrocytorganisation som en billedbaseret biomarkør for tidlig bruskdegeneration, giver mulighed for ikke kun at kvantificere, men også faktisk identificere de tidligste degenerative mekaniske ændringer. Disse resultater er allerede blevet bekræftet af andre^23,24. Derfor fungerer AFM-IT som et interessant værktøj til at diagnosticere og identificere tidlige degenerative ændringer. Disse ændringer kan allerede måles på cellulært niveau, hvilket omformer forståelsen af OA-patofysiologisk proces.

I denne protokol demonstrerer vi en komplet histologisk og biomekanisk klassificeringsprocedure for ledbruskeksplanter, fra native bruskeksplantatforberedelse til AFM-dataindsamling og -behandling. Gennem en trinvis tilgang viser vi, hvordan man genererer, klassificerer og visuelt klassificerer ledbruskvæv i henhold til forskellige stadier af degeneration ved hjælp af 2D stor mosaikbilleddannelse efterfulgt af mikro-AFM-fordybninger.

Selvom AFM-IT i øjeblikket er et af de mest følsomme værktøjer til måling af biomekaniske ændringer i brusk⁷, har det som enhver anden instrumentel teknik begrænsninger og praktiske særegenheder²⁵, der kan føre til fejlagtig dataindsamling. Til dette formål undersøger vi de mest almindelige problemer, der opstår under AFM-målinger af bruskeksanlæggene, og beskriver, hvor det er muligt, hvordan man minimerer eller overvinder dem. Disse omfatter topografiske aspekter af prøverne og vanskelighederne med at stabilisere dem i et AFM-kompatibelt miljø, fysiske egenskaber ved vævets overflade og de deraf følgende vanskeligheder med at udføre AFM-målinger på sådanne overflader. Eksempler på fejlagtige kraftafstandskurver præsenteres også, hvilket understreger de forhold, der kan forårsage dem. Yderligere begrænsninger, der er forbundet med cantileverspidsens geometri og brugen af Hertz-modellen til dataanalysen, diskuteres også.

Protocol

Femoral kondyler indsamlet fra patienter, der gennemgik total knæ artroplastik på universitetshospitalet i Tübingen, Tyskland, blev brugt. Kun ledbruskprøver fra patienter med degenerative og posttraumatiske ledpatologier blev inkluderet i denne undersøgelse. Afdelingsmæssige, institutionelle såvel som lokale etiske udvalgs godkendelse blev opnået inden undersøgelsens påbegyndelse (projekt nr. 674/2016BO2). Der blev modtaget skriftligt informeret samtykke fra alle patienter før deltagelse. <p class="jove_c…

Representative Results

Ved hjælp af en selvfremstillet skæreanordning var vi i stand til at eksplante og generere små (4 mm x 1 mm) bruskskiver fra friske humane kondyler indeholdende et enkelt cellulært rumligt mønster30 af enkeltstrenge (SS, figur 2A), dobbeltstrenge (DS), små klynger (SC), store klynger (BC; Figur 2A) og diffus (figur 2B). En repræsentativ bruskeksplante er afbildet i figur 3A</strong…

Discussion

Som en progressiv og multifaktoriel sygdom udløser OA strukturelle og funktionelle ændringer i ledbrusk. I løbet af OA ledsages forringelser i mekaniske egenskaber af strukturelle og biokemiske ændringer på overfladen af ledbrusk^27,31. De tidligste patologiske hændelser, der forekommer i OA, er proteoglycanudtømning kombineret med kollagennetværksforstyrrelse^{32,33,34</…}

Materials

Amphotericin B	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1397-89-3
Atomic force microscop (AFM) head	CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	JPK00518
Biocompatible sample glue	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	H000033
Calcein AM	Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA	14948	Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging
Cantilever	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SAA-SPH-5UM	Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm,  geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius
Cartilage ctting device	Self-made	n/a	Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm
CDD camera integrated in the AFM	The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany	DFK 31BF03
CDD camera integrated in the fluorescence microscope	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	DFC3000G
Cryotome	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	CM3050S
Data Processing Software for the AFM	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	Version 5.0.86,  can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany	41966052
Fluorescence Microscope (Leica DMi8)	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	11889113
Glass block cantiliver holder	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SP-90-05	Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	F1315
Microscope glass slides	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS294775X50
Mounting medium With DAPI	ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany	50011	Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs  side view imaging
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P4333
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater)	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	T-05-0117
Scalpel	Feather Medical Products, Osaka, Japan	2023-01
Silicone Skirt	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent  medium condensation in the AFM head.
Statistical program – SPSS	IBM, Armonk, New York, USA	SPSS Statistics 22	Vesion 280.0.0.0 (190)
Tissue culture dishes	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	SA6255012	Water-soluble embedding medium