טיפול בסוגיות מעשיות במיקרו-הזחה מבוססת מיקרוסקופיה של כוח אטומי על צמחי סחוס מפרקיים אנושיים

Summary

אנו מציגים גישה שלב אחר שלב לזיהוי וטיפול בבעיות הנפוצות ביותר הקשורות למיקרו-כניסות במיקרוסקופ כוח אטומי. אנו מדגימים את הבעיות המתעוררות על צמחי סחוס מפרקי אנושיים מקומיים המאופיינים בדרגות שונות של ניוון המונע על ידי אוסטאוארתריטיס.

Abstract

ללא ספק, מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הוא כיום אחת הטכניקות החזקות והשימושיות ביותר להערכת מיקרו ואפילו ננו-רמזים בתחום הביולוגי. עם זאת, כמו בכל גישה מיקרוסקופית אחרת, אתגרים מתודולוגיים יכולים להתעורר. בפרט, המאפיינים של המדגם, הכנת הדגימה, סוג המכשיר, ואת הבדיקה הזחה יכול להוביל ממצאים לא רצויים. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את הבעיות המתעוררות הללו על צמחי סחוס מפרקי בריאים כמו גם ניווניים. לשם כך, אנו מראים תחילה באמצעות גישה שלב אחר שלב כיצד ליצור, לדרג ולסווג באופן חזותי דיסקיות סחוס מפרקי ex vivo לפי שלבים שונים של ניוון באמצעות הדמיה פלואורסצנטית דו-ממדית גדולה של פסיפס שלם של כל צמחי הרקמה. החוזק העיקרי של מודל ex vivo הוא בכך שהוא מורכב מסחוס אנושי זקן, ילידי, המאפשר לחקור שינויים הקשורים לדלקת מפרקים ניוונית מהתחלה מוקדמת ועד להתקדמות. בנוסף, מוצגים גם מלכודות נפוצות בהכנת רקמות, כמו גם הליך AFM בפועל יחד עם ניתוח הנתונים הבאים. אנו מראים כיצד שלבים בסיסיים אך חיוניים כגון הכנה ועיבוד דגימה, מאפייני דגימה טופוגרפיים הנגרמים על ידי ניוון מתקדם ואינטראקציה בין קצה הדגימה יכולים להשפיע על רכישת נתונים. אנו גם נתונים לבדיקה של הבעיות הנפוצות ביותר ב- AFM ומתארים, במידת האפשר, כיצד להתגבר עליהן. ידיעת מגבלות אלה היא בעלת חשיבות עליונה לאיסוף נכון של נתונים, פרשנותם, ובסופו של דבר, להטמעת הממצאים בהקשר מדעי רחב.

Introduction

בשל גודלם ההולך ומצטמצם של מכשירים ומערכות אלקטרוניים, ההתפתחות המהירה של טכנולוגיה וציוד מבוססי מיקרו וננו צברה תאוצה. מכשיר אחד כזה הוא מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), שיכול לסרוק משטחים ביולוגיים ולאחזר מידע טופוגרפי או ביומכני בקנה מידה ננומטרי ומיקרומטרי ^1,2. בין התכונות העצומות שלה, כלי זה יכול להיות מופעל כמו מיקרו, כמו גם nano-indenter כדי לקבל מידע על התכונות המכניות של מערכות ביולוגיות שונות 3,4,5,6. הנתונים נאספים על ידי מגע פיזי עם פני השטח באמצעות בדיקה מכנית, אשר יכול להיות קטן כמו 1 ננומטר בקצה שלה⁷. העיוות שנוצר של הדגימה מוצג לאחר מכן בהתבסס על עומק הכניסה של קצה הקנטיל והכוח המופעל על הדגימה⁸.

דלקת מפרקים ניוונית (OA) היא מחלה כרונית ניוונית ארוכת טווח המאופיינת בהידרדרות הסחוס המפרקי במפרקים וברקמות הסובבות, מה שעלול להוביל לחשיפה מלאה של משטחי העצם. הנטל של OA הוא משמעותי; כיום, מחצית מכלל הנשים ושליש מכלל הגברים בגילאי 65 ומעלה סובלים מ-OA⁹. טראומות, השמנת יתר והביומכניקה המשתנה של המפרק¹⁰ כתוצאה מכך קובעים את ניוון הסחוס המפרקי, אשר נתפס כתוצאה סופית שכיחה. המחקר החלוצי של גנץ ועמיתיו הניח כי השלבים המוקדמים של תהליך OA עשויים לכלול את התכונות הביומכניות של סחוס¹¹, ומאז אישרו החוקרים השערה זו¹². כמו כן, מקובל כי התכונות הביומכניות של הרקמה מתוזמרות באופן פונקציונלי על ידי הארגון האולטרה-סטרוקטורלי, כמו גם קרוס-טוק תא-תא ומטריצת תא. כל שינוי יכול להשפיע באופן דרמטי על התפקוד הביומכני הכולל של הרקמה¹³. נכון להיום, אבחון OA הוא קליני ומבוסס על רדיוגרפיה רגילה¹⁴. גישה זו היא דו-צדדית: ראשית, היעדר סף חתך ניווני מוגדר לגיבוש האבחנה של OA מקשה על כימות, ושנית, שיטות הדמיה חסרות רגישות ותקינה ואינן יכולות לזהות נזק סחוס מקומי^15,16,17. לשם כך, להערכת התכונות המכניות של הסחוס יש יתרון מכריע בכך שהיא מתארת פרמטר המשתנה במהלך OA ללא קשר לאטיולוגיה של המחלה ויש לו השפעה ישירה על תפקוד הרקמה בשלב מוקדם מאוד. מכשירי הזחה מודדים את הכוח שבו הרקמה מתנגדת להזחה. זהו, למעשה, לא מושג חדש; המחקרים המוקדמים ביותר מתוארכים לשנות ה-80 וה-90. בתקופה זו, מחקרים רבים הציעו כי מכשירי הזחה המיועדים למדידות ארתרוסקופיות של סחוס מפרקי יכולים להתאים היטב לזיהוי שינויים ניווניים בסחוס. אפילו לפני 30 שנה, כמה מחקרים הצליחו להוכיח כי מכשירי הזחה היו מסוגלים לזהות שינויים in vivo פני השטח של הסחוס במהלך ניוון רקמות על ידי ביצוע מדידות קשיחות דחיסה במהלך ארתרוסקופיה^18,19,20.

כניסת AFM (AFM-IT) של הסחוס המפרקי מספקת מידע על תכונה מכנית מרכזית של הרקמה, כלומר נוקשות. זהו פרמטר מכני המתאר את הקשר בין עומס מוחל, לא הרסני לבין העיוות שנוצר כתוצאה מכך של אזור הרקמה המושקעת²¹. AFM-IT הוכח כמסוגל לכמת שינויים תלויי גיל בנוקשות ברשתות קולגן מקרוסקופיות שאינן מושפעות, ובכך להבדיל בין השינויים הפתולוגיים הקשורים להופעת OA (דרגה 0 בסולם Outerbridge בסחוס מפרקי)²². הראינו בעבר כי AFM-ITs, על בסיס ארגון כונדרוציטים מרחביים כסמן ביולוגי מבוסס תמונה לניוון סחוס מוקדם, מאפשרים לא רק לכמת אלא גם לאתר בפועל את השינויים המכניים הניווניים המוקדמים ביותר. ממצאים אלה כבר אושרו על ידי אחרים^23,24. לפיכך, AFM-IT פועל ככלי מעניין לאבחון וזיהוי שינויים ניווניים מוקדמים. שינויים אלה ניתנים למדידה כבר ברמה התאית, ומעצבים מחדש את ההבנה של התהליך הפתופיזיולוגי OA.

בפרוטוקול זה, אנו מדגימים הליך דירוג היסטולוגי וביומכני מלא של צמחי סחוס מפרקיים, החל מהכנת צמחי סחוס מקומיים ועד לרכישה ועיבוד של נתוני AFM. באמצעות גישה שלב אחר שלב, אנו מראים כיצד ליצור, לדרג ולסווג חזותית רקמת סחוס מפרקי לפי שלבים שונים של ניוון באמצעות דימות פסיפס גדול דו-ממדי, ואחריו כניסות מיקרו-AFM.

למרות שכיום, AFM-IT הוא אחד הכלים הרגישים ביותר למדידת שינויים ביומכניים בסחוס⁷, כמו כל טכניקה אינסטרומנטלית אחרת, יש לו מגבלות ומוזרויות מעשיות²⁵ שיכולות להוביל לרכישת נתונים שגויה. לשם כך, אנו בוחנים את הבעיות הנפוצות ביותר המתעוררות במהלך מדידות AFM של צמחי הסחוס ומתארים, במידת האפשר, כיצד למזער או להתגבר עליהן. אלה כוללים היבטים טופוגרפיים של הדגימות והקשיים לייצב אותן בסביבה תואמת AFM, מוזרויות פיזיות של פני הרקמה, והקשיים הנובעים מכך בביצוע מדידות AFM על משטחים כאלה. מוצגות גם דוגמאות לעקומות כוח מרחק שגויות, המדגישות את התנאים שעלולים לגרום להן. כמו כן נדונות מגבלות נוספות הטבועות בגיאומטריה של קצה הקנטיליבר ובשימוש במודל הרץ לניתוח הנתונים.

Protocol

נעשה שימוש בקונדילים של עצם הירך שנאספו מחולים שעברו ניתוח ארתרופלסטי כולל של הברך בבית החולים האוניברסיטאי של טובינגן, גרמניה. במחקר זה נכללו רק דגימות סחוס מפרקי מחולים עם פתולוגיות מפרקים ניווניות ופוסט-טראומטיות. אישור ועדת האתיקה המחלקתית, המוסדית והמקומית התקבל לפני תחילת המחקר (פ?…

Representative Results

באמצעות מכשיר חיתוך מתוצרת עצמית, הצלחנו לשתול וליצור דיסקיות סחוס קטנות (4 מ”מ x 1 מ”מ) מקונדילים אנושיים טריים המכילים תבנית מרחבית תאית אחת30 של מיתרים בודדים (SS, איור 2A), מיתרים כפולים (DS), אשכולות קטנים (SC), אשכולות גדולים (BC; איור 2A), ומפוזר (<strong cla…

Discussion

כמחלה מתקדמת ורב-גורמית, OA מעוררת שינויים מבניים ותפקודיים בסחוס המפרקי. במהלך OA, ליקויים בתכונות מכניות מלווים בשינויים מבניים וביוכימיים על פני השטח של הסחוס המפרקי^27,31. האירועים הפתולוגיים המוקדמים ביותר המתרחשים ב- OA הם דלדול פרוטאוגליקן יחד עם הפרעה בר…

Materials

Amphotericin B	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1397-89-3
Atomic force microscop (AFM) head	CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	JPK00518
Biocompatible sample glue	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	H000033
Calcein AM	Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA	14948	Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging
Cantilever	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SAA-SPH-5UM	Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm,  geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius
Cartilage ctting device	Self-made	n/a	Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm
CDD camera integrated in the AFM	The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany	DFK 31BF03
CDD camera integrated in the fluorescence microscope	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	DFC3000G
Cryotome	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	CM3050S
Data Processing Software for the AFM	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	Version 5.0.86,  can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany	41966052
Fluorescence Microscope (Leica DMi8)	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	11889113
Glass block cantiliver holder	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SP-90-05	Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	F1315
Microscope glass slides	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS294775X50
Mounting medium With DAPI	ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany	50011	Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs  side view imaging
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P4333
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater)	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	T-05-0117
Scalpel	Feather Medical Products, Osaka, Japan	2023-01
Silicone Skirt	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent  medium condensation in the AFM head.
Statistical program – SPSS	IBM, Armonk, New York, USA	SPSS Statistics 22	Vesion 280.0.0.0 (190)
Tissue culture dishes	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	SA6255012	Water-soluble embedding medium