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Bioengenharia

原子間力顕微鏡を用いたヒト関節軟骨外植片のマイクロインデンテーションにおける実用的課題への対処

Published: October 28, 2022
doi:
10.3791/64371
, , ,
1Laboratory of Cell Biology, Department of Orthopaedic Surgery,University Hospital Tübingen, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery,University Hospital Tübingen

Summary

原子間力顕微鏡のマイクロインデンテーションに関連する最も一般的な問題を特定し、対処するための段階的なアプローチを紹介します。私たちは、変形性関節症によるさまざまな程度の変性を特徴とする天然のヒト関節軟骨外植片の新たな問題を例示しています。

Abstract

原子間力顕微鏡(AFM)は、現在、生物学的分野におけるマイクロやナノキューを評価するための最も強力で有用な技術の1つであることは間違いありません。しかし、他の微視的アプローチと同様に、方法論的な課題が生じる可能性があります。特に、サンプルの特性、サンプル調製、装置の種類、およびインデンテーションプローブは、望ましくないアーチファクトにつながる可能性があります。このプロトコルでは、健康な変形性関節軟骨外植片だけでなく、変形性関節症の関節軟骨外植片に関するこれらの新たな問題を例示します。この目的のために、まず、組織外植片全体の大規模な2Dモザイク蛍光イメージングにより、変性のさまざまな段階に応じてex vivo関節軟骨椎間板を生成、等級付け、および視覚的に分類する方法を段階的なアプローチで示します。ex vivoモデルの主な強みは、老化した天然のヒト軟骨で構成されており、変形性関節症の早期発症から進行までの変化を調査できることです。さらに、組織調製における一般的な落とし穴、および実際のAFM手順とその後のデータ解析についても説明します。サンプルの調製と処理、高度な縮性によって引き起こされるトポグラフィーサンプルの特性、サンプルとチップの相互作用など、基本的かつ重要なステップがデータ取得にどのように影響するかを示します。また、AFMの最も一般的な問題を精査し、可能であれば、それらを克服する方法を説明します。これらの限界に関する知識は、正しいデータの取得、解釈、そして最終的には幅広い科学的文脈への発見の埋め込みにとって最も重要です。

Introduction

電子機器やシステムの小型化に伴い、マイクロ・ナノベースの技術や機器の急速な発展が加速しています。そのようなデバイスの1つが原子間力顕微鏡(AFM)で、生体表面をスキャンし、ナノメートルスケールとマイクロメートルスケールの両方で地形情報または生体力学的情報を取得できます1,2。その膨大な機能の中で、このツールは、さまざまな生物学的システムの機械的特性に関する情報を取得するためのマイクロおよびナノインデンターとして操作できます3,4,5,6。データは、先端部で約1nmと小さくなり得る機械プローブを介して表面と物理的に接触することによって収集される7。次に、試料の結果として生じる変形は、片持ち梁先端のくぼみの深さと試料8に加えられた力に基づいて表示される。

変形性関節症(OA)は、関節および周辺組織の関節軟骨の劣化を特徴とする長期の変性慢性疾患であり、骨表面の完全な露出につながる可能性があります。オープンアクセスの負担は相当なものです。現在、65歳以上の女性の半数、男性の3分の1がOA9に罹患しています。外傷、肥満、およびその結果生じる関節10の変化した生体力学は、関節軟骨変性を決定し、これは一般的な最終結果と見なされる。Ganzらの先駆的な研究は、OAプロセスの初期段階には軟骨の生体力学的特性が関与している可能性があると仮定し11、それ以来、研究者はこの仮説を確認してきました12。同様に、組織の生体力学的特性は、超微細構造組織、ならびに細胞間および細胞マトリックスのクロストークによって機能的に調整されることが一般的に認められています。いかなる変化も、組織全体の生体力学的機能に劇的な影響を与える可能性がある13。今日まで、OA診断は臨床的であり、プレーンフィルムX線撮影に基づいている14。このアプローチは2つの側面があります:第一に、OAの診断を定式化するための定義された変性カットオフ閾値がないため、状態の定量化が困難になり、第二に、イメージング法は感度と標準化を欠いており、局所的な軟骨損傷を検出できません15,16,17。この目的のために、軟骨の機械的特性の評価は、疾患の病因に関係なくOAの過程で変化するパラメータを記述し、非常に早い段階で組織の機能に直接影響を与えるという決定的な利点を有する。圧痕器具は、組織が圧痕に抵抗する力を測定します。実際、これは新しい概念ではありません。初期の研究は1980年代と1990年代にさかのぼります。この時期、多くの研究により、関節軟骨の関節鏡視下測定用に設計された圧痕器具が軟骨の変性変化を検出するのに適している可能性があることが示唆されました。30年前でさえ、いくつかの研究は、関節鏡検査中に圧縮剛性測定を行うことにより、組織変性中の軟骨表面のin vivo変化をインデンテーション機器が検出できることを実証することができました18,19,20。

関節軟骨のAFMインデンテーション(AFM-IT)は、組織の極めて重要な機械的特性、すなわち硬さに関する情報を提供します。これは、加えられた非破壊荷重と、くぼみのある組織領域21の結果として生じる変形との関係を記述する機械的パラメータである。AFM-ITは、巨視的に影響を受けていないコラーゲンネットワークにおける硬さの加齢による変化を定量化できることが示されており、したがって、OA発症に関連する病理学的変化(関節軟骨のアウターブリッジスケールでグレード0)を区別することができます22。AFM-ITは、軟骨細胞の早期変性を示す画像ベースのバイオマーカーとして、軟骨細胞の空間的組織化に基づいて、定量化だけでなく、最も初期の変性機械的変化を実際に特定できることを示しました。これらの発見は、すでに他の人によって確認されています23,24。したがって、AFM-ITは、初期の変性変化を診断および特定するための興味深いツールとして機能します。これらの変化はすでに細胞レベルで測定されており、OAの病態生理学的プロセスの理解を再構築しています。

このプロトコルでは、天然の軟骨外植片の準備からAFMデータの取得と処理まで、関節軟骨外植片の完全な組織学的および生体力学的等級付け手順を実証します。ステップバイステップのアプローチにより、2D大型モザイクイメージングとそれに続くマイクロAFMインデンテーションにより、変性のさまざまな段階に応じて関節軟骨組織を生成、等級付け、および視覚的に分類する方法を示します。

現在、AFM-ITは、他の機器技術と同様に、軟骨の生体力学的変化を測定するための最も感度の高いツールの1つですが7、誤ったデータ収集につながる可能性のある制限と実用的な特殊性25があります。そのために、軟骨外植片のAFM測定中に発生する最も一般的な問題を精査し、可能であれば、それらを最小化または克服する方法を説明します。これらには、サンプルの地形的側面と、AFM互換環境でサンプルを安定させることの難しさ、組織表面の物理的特性、およびそのような表面でAFM測定を行うことの難しさが含まれます。また、誤った力-距離曲線の例も示され、それらを引き起こす可能性のある条件が強調されています。また、カンチレバー先端の形状に固有の制限や、データ解析にヘルツモデルを使用することについても説明します。

Protocol

ドイツのテュービンゲン大学病院で人工膝関節全置換術を受けている患者から採取した大腿骨顆が使用されました。この研究には、変性および心的外傷後関節病変のある患者からの関節軟骨サンプルのみが含まれていました。研究の開始前に、部門、機関、および地域の倫理委員会の承認が得られました (プロジェクト番号 674/2016BO2)。参加前にすべての患者から書面によるインフォームドコ?…

Representative Results

自作の切断装置を用いて、単一糸(SS、図2A)、二重糸(DS)、小クラスター(SC)、大クラスター(BC;図2A)、および拡散(図2B)です。代表的な軟骨外植片を図3Aに示します。1種類のパターンのみを表示するディスクの選択は、トップダウン蛍光イメージングを使用して行われました(<strong class="xfig"…

Discussion

進行性および多因子性疾患として、OAは関節軟骨の構造的および機能的変化を引き起こします。OAの過程を通じて、機械的特徴の障害は、関節軟骨の表面における構造的および生化学的変化を伴う27,31。OAで発生する最も初期の病理学的事象は、コラーゲンネットワークの破壊と組み合わされたプロテオグリカンの枯渇である32,33,34?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

組織サンプルを提供してくださったテュービンゲン大学病院整形外科の整形外科医に感謝します。

Materials

Amphotericin B Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1397-89-3
Atomic force microscop (AFM) head  CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany JPK00518
Biocompatible sample glue  Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany H000033
Calcein AM Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA 14948 Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging
Cantilever Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany SAA-SPH-5UM Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm,  geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius
Cartilage ctting device  Self-made  n/a Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm
CDD camera integrated in the AFM The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany DFK 31BF03
CDD camera integrated in the fluorescence microscope Leica Biosystems, Wetzlar, Germany DFC3000G
Cryotome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany CM3050S 
Data Processing Software for the AFM Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany n/a Version 5.0.86,  can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)  Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany 41966052
Fluorescence Microscope (Leica DMi8) Leica Biosystems, Wetzlar, Germany 11889113
Glass block cantiliver holder Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany SP-90-05 Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM) AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine  Merck KGaA, Darmstadt, Germany F1315
Microscope glass slides Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA CLS294775X50
Mounting medium With DAPI ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany 50011 Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs  side view imaging
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA P4333
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater) Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany T-05-0117
Scalpel Feather Medical Products, Osaka, Japan 2023-01
Silicone Skirt Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany n/a Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent  medium condensation in the AFM head.
Statistical program – SPSS IBM, Armonk, New York, USA SPSS Statistics 22 Vesion 280.0.0.0 (190)
Tissue culture dishes  TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands SA6255012 Water-soluble embedding medium 
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Citar este artigo
Daniel, C., Alexander, D., Umrath, F., Danalache, M. Addressing Practical Issues in Atomic Force Microscopy-Based Micro-Indentation on Human Articular Cartilage Explants. J. Vis. Exp. (188), e64371, doi:10.3791/64371 (2022).
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