Adressering av praktiske problemer i atomkraftmikroskopibasert mikroinnrykk på menneskelige leddbruskeksplanter

Summary

Vi presenterer en trinnvis tilnærming for å identifisere og løse de vanligste problemene knyttet til atomkraftmikroskopiske mikroinnrykk. Vi eksemplifiserer de nye problemene på innfødte menneskelige leddbruskeksplanter preget av ulike grader av slitasjegiktdrevet degenerasjon.

Abstract

Uten tvil er atomkraftmikroskopi (AFM) for tiden en av de kraftigste og mest nyttige teknikkene for å vurdere mikro- og til og med nano-signaler i det biologiske feltet. Men som med alle andre mikroskopiske tilnærminger kan det oppstå metodiske utfordringer. Spesielt kan egenskapene til prøven, prøvepreparering, type instrument og innrykkssonde føre til uønskede artefakter. I denne protokollen eksemplifiserer vi disse nye problemene på sunne så vel som osteoartrittiske leddbruskeksplanter. For dette formål viser vi først via en trinnvis tilnærming hvordan man genererer, graderer og visuelt klassifiserer ex vivo leddbruskskiver i henhold til forskjellige stadier av degenerasjon ved hjelp av stor 2D-mosaikkfluorescensavbildning av hele vevseksplanter. Den største styrken til ex vivo-modellen er at den består av eldre, innfødt, human brusk som gjør det mulig å undersøke slitasjegiktrelaterte endringer fra tidlig begynnelse til progresjon. I tillegg presenteres også vanlige fallgruver i vevspreparering, samt selve AFM-prosedyren sammen med den påfølgende dataanalysen. Vi viser hvordan grunnleggende, men avgjørende trinn som prøvepreparering og -behandling, topografiske prøveegenskaper forårsaket av avansert degenerasjon og interaksjon mellom prøver og spisser kan påvirke datainnsamlingen. Vi underkaster også gransking de vanligste problemene i AFM og beskriver, der det er mulig, hvordan vi kan overvinne dem. Kunnskap om disse begrensningene er av største betydning for riktig datainnsamling, tolkning og til slutt innlemming av funn i en bred vitenskapelig sammenheng.

Introduction

På grunn av den stadig krympende størrelsen på elektroniske enheter og systemer, har den raske utviklingen av mikro- og nanobasert teknologi og utstyr fått fart. En slik enhet er atomkraftmikroskopi (AFM), som kan skanne biologiske overflater og hente topografisk eller biomekanisk informasjon på både nano- og mikrometerskala ^1,2. Blant de enorme funksjonene kan dette verktøyet betjenes som en mikro- så vel som en nano-indenter for å få informasjon om de mekaniske egenskapene til forskjellige biologiske systemer 3,4,5,6. Dataene samles inn ved fysisk kontakt med overflaten gjennom en mekanisk sonde, som kan være så liten som ca. 1 nm på spissen⁷. Den resulterende deformasjonen av prøven vises deretter basert på innrykksdybden til utkragingsspissen og kraften som påføres prøven⁸.

Slitasjegikt (OA) er en langvarig degenerativ kronisk sykdom preget av forverring av leddbrusk i leddene og omkringliggende vev, noe som kan føre til fullstendig eksponering av beinoverflatene. Byrden ved OA er betydelig; For tiden lider halvparten av alle kvinner og en tredjedel av alle menn i alderen 65 og over av OA⁹. Traumer, fedme og den resulterende endrede biomekanikken til leddet¹⁰ bestemmer leddbruskdegenerasjonen, som blir sett på som et vanlig sluttresultat. Den banebrytende studien av Ganz et al. antydet at de tidlige trinnene i OA-prosessen kan innebære de biomekaniske egenskapene til brusk¹¹, og siden da har forskere bekreftet denne hypotesen¹². På samme måte er det generelt akseptert at de biomekaniske egenskapene til vevet er funksjonelt orkestrert av den ultrastrukturelle organisasjonen, så vel som cellecelle- og cellematrisekrysstale. Eventuelle endringer kan dramatisk påvirke den generelle vevsbiomekaniske funksjonen¹³. Hittil er OA-diagnosen klinisk og er basert på vanlig filmradiografi¹⁴. Denne tilnærmingen er tosidig: For det første gjør mangelen på en definert degenerativ grenseverdi for å formulere diagnosen OA tilstanden vanskelig å kvantifisere, og for det andre mangler bildebehandlingsmetoder sensitivitet og standardisering og kan ikke oppdage lokaliserte bruskskader^15,16,17. For dette formål har vurderingen av bruskens mekaniske egenskaper den avgjørende fordelen at den beskriver en parameter som endres i løpet av OA uavhengig av sykdommens etiologi og har en direkte innflytelse på vevsfunksjonalitet på et svært tidlig stadium. Innrykksinstrumenter måler kraften som vevet motstår innrykket med. Dette er faktisk ikke et nytt konsept; De tidligste studiene går tilbake til 1980- og 1990-tallet. I denne perioden antydet mange studier at innrykksinstrumenter designet for artroskopiske målinger av leddbrusk kunne være godt egnet til å oppdage degenerative forandringer i brusk. Selv for 30 år siden var noen studier i stand til å demonstrere at innrykksinstrumenter var i stand til å oppdage in vivo-endringer i bruskoverflaten under vevsdegenerasjon ved å utføre trykkstivhetsmålinger under artroskopi^18,19,20.

AFM-innrykk (AFM-IT) av leddbrusk gir informasjon om en pivotal mekanisk egenskap av vevet, nemlig stivhet. Dette er en mekanisk parameter som beskriver forholdet mellom en påført, ikke-destruktiv belastning og den resulterende deformasjonen av det innrykkede vevsområdet²¹. AFM-IT har vist seg å være i stand til å kvantifisere aldersavhengige modifikasjoner i stivhet i makroskopisk upåvirkede kollagennettverk, og dermed skille mellom de patologiske endringene forbundet med OA-utbrudd (grad 0 på Outerbridge-skalaen i leddbrusk)²². Vi har tidligere vist at AFM-IT, på grunnlag av romlig kondrocyttorganisasjon som en bildebasert biomarkør for tidlig bruskdegenerasjon, tillater ikke bare kvantifisering, men også faktisk å identifisere de tidligste degenerative mekaniske endringene. Disse funnene er allerede bekreftet av andre^23,24. Derfor fungerer AFM-IT som et interessant verktøy for å diagnostisere og identifisere tidlige degenerative endringer. Disse endringene kan allerede måles på cellenivå, og omforme forståelsen av OAs patofysiologiske prosess.

I denne protokollen demonstrerer vi en komplett histologisk og biomekanisk graderingsprosedyre for leddbruskeksplanter, fra innfødt bruskpreparering til AFM-datainnsamling og -behandling. Gjennom en trinnvis tilnærming viser vi hvordan man genererer, graderer og visuelt klassifiserer leddbruskvev i henhold til forskjellige stadier av degenerasjon ved hjelp av 2D stor mosaikkavbildning, etterfulgt av mikro-AFM-innrykk.

Selv om AFM-IT for tiden er et av de mest følsomme verktøyene for å måle biomekaniske endringer i brusk⁷, som enhver annen instrumentell teknikk, har den begrensninger og praktiske særegenheter²⁵ som kan føre til feilaktig datainnsamling. For dette formål underkaster vi gransking de vanligste problemene som oppstår under AFM-målinger av bruskeksplantene og beskriver, der det er mulig, hvordan vi kan minimere eller overvinne dem. Disse inkluderer topografiske aspekter av prøvene og vanskelighetene med å stabilisere dem i et AFM-kompatibelt miljø, fysiske særegenheter av vevets overflate og de resulterende vanskelighetene med å utføre AFM-målinger på slike overflater. Eksempler på feilaktige kraftavstandskurver presenteres også, med vekt på forholdene som kan forårsake dem. Ytterligere begrensninger knyttet til geometrien til utkragingsspissen og bruken av Hertz-modellen for dataanalysen diskuteres også.

Protocol

Femoralkondyler samlet fra pasienter som gjennomgår total kneproteseplastikk ved Universitetssykehuset i Tübingen, Tyskland, ble brukt. Kun leddbruskprøver fra pasienter med degenerative og posttraumatiske leddpatologier ble inkludert i denne studien. Godkjenning fra avdelinger, institusjoner og lokale etiske komiteer ble innhentet før studiestart (prosjektnr.674/2016BO2). Det ble innhentet skriftlig informert samtykke fra alle pasientene før deltakelse. MERK: Et flytskjema over eksperime…

Representative Results

Ved hjelp av et selvfremstillet skjæreapparat kunne vi eksplantere og generere små (4 mm x 1 mm) bruskskiver fra ferske menneskelige kondyler som inneholder et enkelt cellulært romlig mønster30 enkeltstrenger (SS, figur 2A), doble strenger (DS), små klynger (SC), store klynger (BC; figur 2A), og diffus (figur 2B). En representativ bruskeksplante er avbildet i figur 3A. Valge…

Discussion

Som en progressiv og multifaktoriell sykdom utløser OA strukturelle og funksjonelle endringer i leddbrusk. I løpet av OA ledsages svekkelser i mekaniske egenskaper av strukturelle og biokjemiske endringer på overflaten av leddbrusk^27,31. De tidligste patologiske hendelsene som forekommer i OA er proteoglykanuttømming kombinert med kollagennettverksforstyrrelser^{32,33,34</su…}

Materials

Amphotericin B	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1397-89-3
Atomic force microscop (AFM) head	CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	JPK00518
Biocompatible sample glue	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	H000033
Calcein AM	Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA	14948	Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging
Cantilever	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SAA-SPH-5UM	Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm,  geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius
Cartilage ctting device	Self-made	n/a	Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm
CDD camera integrated in the AFM	The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany	DFK 31BF03
CDD camera integrated in the fluorescence microscope	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	DFC3000G
Cryotome	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	CM3050S
Data Processing Software for the AFM	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	Version 5.0.86,  can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany	41966052
Fluorescence Microscope (Leica DMi8)	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	11889113
Glass block cantiliver holder	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SP-90-05	Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	F1315
Microscope glass slides	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS294775X50
Mounting medium With DAPI	ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany	50011	Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs  side view imaging
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P4333
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater)	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	T-05-0117
Scalpel	Feather Medical Products, Osaka, Japan	2023-01
Silicone Skirt	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent  medium condensation in the AFM head.
Statistical program – SPSS	IBM, Armonk, New York, USA	SPSS Statistics 22	Vesion 280.0.0.0 (190)
Tissue culture dishes	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	SA6255012	Water-soluble embedding medium