Abordaje de cuestiones prácticas en la microindentación basada en microscopía de fuerza atómica en explantes de cartílago articular humano

Summary

Presentamos un enfoque paso a paso para identificar y abordar los problemas más comunes asociados con las microindentaciones de microscopía de fuerza atómica. Ejemplificamos los problemas emergentes en los explantes nativos de cartílago articular humano caracterizados por varios grados de degeneración impulsada por la osteoartritis.

Abstract

Sin lugar a dudas, la microscopía de fuerza atómica (AFM) es actualmente una de las técnicas más potentes y útiles para evaluar micro e incluso nano-señales en el campo biológico. Sin embargo, al igual que con cualquier otro enfoque microscópico, pueden surgir desafíos metodológicos. En particular, las características de la muestra, la preparación de la muestra, el tipo de instrumento y la sonda de indentación pueden dar lugar a artefactos no deseados. En este protocolo, ejemplificamos estos problemas emergentes en explantes de cartílago articular sanos y osteoartríticos. Con este fin, primero mostramos a través de un enfoque paso a paso cómo generar, clasificar y clasificar visualmente discos de cartílago articular ex vivo de acuerdo con diferentes etapas de degeneración mediante imágenes de fluorescencia de mosaico 2D de gran tamaño de los explantes de tejido completo. La principal fortaleza del modelo ex vivo es que comprende cartílago humano nativo envejecido que permite la investigación de los cambios relacionados con la osteoartritis desde el inicio temprano hasta la progresión. Además, también se presentan los errores más comunes en la preparación de los tejidos, así como el procedimiento real de MFA junto con el posterior análisis de los datos. Mostramos cómo los pasos básicos pero cruciales, como la preparación y el procesamiento de la muestra, las características topográficas de la muestra causadas por la degeneración avanzada y la interacción muestra-punta, pueden afectar la adquisición de datos. También sometemos a escrutinio los problemas más comunes en la AFM y describimos, en la medida de lo posible, cómo superarlos. El conocimiento de estas limitaciones es de suma importancia para la correcta adquisición de datos, la interpretación y, en última instancia, la incorporación de los hallazgos en un contexto científico amplio.

Introduction

Debido al tamaño cada vez menor de los dispositivos y sistemas electrónicos, el rápido desarrollo de la tecnología y los equipos basados en micro y nano ha cobrado impulso. Uno de estos dispositivos es la microscopía de fuerza atómica (AFM, por sus siglas en inglés), que puede escanear superficies biológicas y recuperar información topográfica o biomecánica a escalas nanométricas y micrométricas ^1,2. Entre sus vastas características, esta herramienta puede ser operada como micro y nano indentador para obtener información sobre las propiedades mecánicas de diversos sistemas biológicos 3,4,5,6. Los datos se recogen por contacto físico con la superficie a través de una sonda mecánica, que puede ser tan pequeña como aproximadamente 1 nm en su punta⁷. A continuación, se muestra la deformación resultante de la muestra en función de la profundidad de indentación de la punta en voladizo y la fuerza aplicada sobre la muestra⁸.

La osteoartritis (OA) es una enfermedad crónica degenerativa a largo plazo caracterizada por el deterioro del cartílago articular en las articulaciones y los tejidos circundantes, lo que puede conducir a la exposición completa de las superficies óseas. La carga de la OA es considerable; actualmente, la mitad de las mujeres y un tercio de los hombres de 65 años o más sufren de OA⁹. Los traumatismos, la obesidad y la consiguiente alteración de la biomecánica de la articulación¹⁰ determinan la degeneración del cartílago articular, que se considera un resultado final común. El estudio pionero de Ganz et al. postuló que los primeros pasos del proceso de artrosis pueden involucrar las propiedades biomecánicas del cartílago¹¹, y desde entonces los investigadores han confirmado esta hipótesis¹². Del mismo modo, es generalmente aceptado que las propiedades biomecánicas del tejido están orquestadas funcionalmente por la organización ultraestructural, así como por la diafonía célula-célula y célula-matriz. Cualquier alteración puede afectar drásticamente el funcionamiento biomecánico general de los tejidos¹³. Hasta la fecha, el diagnóstico de la artrosis es clínico y se basa en la radiografía simple¹⁴. Este enfoque tiene dos caras: en primer lugar, la falta de un umbral de corte degenerativo definido para formular el diagnóstico de OA hace que la afección sea difícil de cuantificar y, en segundo lugar, los métodos de imagen carecen de sensibilidad y estandarización y no pueden detectar daños localizados en el cartílago^15,16,17. Para ello, la evaluación de las propiedades mecánicas del cartílago tiene la ventaja decisiva de que describe un parámetro que cambia durante el curso de la artrosis, independientemente de la etiología de la enfermedad, y que tiene una influencia directa en la funcionalidad tisular en una fase muy temprana. Los instrumentos de indentación miden la fuerza con la que el tejido resiste la indentación. De hecho, este no es un concepto nuevo; Los primeros estudios se remontan a las décadas de 1980 y 1990. En este período, numerosos estudios sugirieron que los instrumentos de indentación diseñados para las mediciones artroscópicas del cartílago articular podrían ser adecuados para detectar cambios degenerativos en el cartílago. Incluso hace 30 años, algunos estudios pudieron demostrar que los instrumentos de indentación eran capaces de detectar in vivo cambios en la superficie del cartílago durante la degeneración tisular mediante la realización de mediciones de rigidez compresiva durante la artroscopia^18,19,20.

La indentación de AFM (AFM-IT) del cartílago articular proporciona información sobre una propiedad mecánica fundamental del tejido, a saber, la rigidez. Se trata de un parámetro mecánico que describe la relación entre una carga aplicada no destructiva y la deformación resultante del área tisular dentada²¹. Se ha demostrado que AFM-IT es capaz de cuantificar las modificaciones de la rigidez dependientes de la edad en redes de colágeno macroscópicamente no afectadas, diferenciando así entre los cambios patológicos asociados a la aparición de la artrosis (grado 0 en la escala de Outerbridge en cartílago articular)²². Hemos demostrado previamente que los AFM-IT, sobre la base de la organización espacial de los condrocitos como un biomarcador basado en imágenes para la degeneración temprana del cartílago, permiten no solo cuantificar, sino también identificar los cambios mecánicos degenerativos más tempranos. Estos hallazgos ya han sido confirmados por otros^23,24. Por lo tanto, AFM-IT actúa como una herramienta interesante para diagnosticar e identificar cambios degenerativos tempranos. Estos cambios ya se pueden medir a nivel celular, remodelando la comprensión del proceso fisiopatológico de la artrosis.

En este protocolo, demostramos un procedimiento completo de clasificación histológica y biomecánica de explantes de cartílago articular, desde la preparación del explante de cartílago nativo hasta la adquisición y procesamiento de datos de AFM. A través de un enfoque paso a paso, mostramos cómo generar, clasificar y clasificar visualmente el tejido del cartílago articular de acuerdo con las diferentes etapas de degeneración mediante imágenes de mosaico grande en 2D, seguidas de indentaciones de micro-AFM.

A pesar de que, en la actualidad, la AFM-IT es una de las herramientas más sensibles para medir los cambios biomecánicos en el cartílago⁷, como cualquier otra técnica instrumental, tiene limitaciones y peculiaridades prácticas²⁵ que pueden llevar a la adquisición errónea de datos. Con este fin, sometemos a escrutinio los problemas más comunes que surgen durante las mediciones de AFM de los explantes de cartílago y describimos, en la medida de lo posible, cómo minimizarlos o superarlos. Estos incluyen los aspectos topográficos de las muestras y las dificultades para estabilizarlas en un entorno compatible con AFM, las peculiaridades físicas de la superficie del tejido y las dificultades resultantes para realizar mediciones de AFM en dichas superficies. También se presentan ejemplos de curvas fuerza-distancia erróneas, haciendo hincapié en las condiciones que pueden causarlas. También se discuten las limitaciones adicionales inherentes a la geometría de la punta en voladizo y el uso del modelo Hertz para el análisis de datos.

Protocol

Se utilizaron cóndilos femorales recogidos de pacientes sometidos a artroplastia total de rodilla en el Hospital Universitario de Tübingen, Alemania. Solo se incluyeron en este estudio muestras de cartílago articular de pacientes con patologías articulares degenerativas y postraumáticas. Antes del inicio del estudio se obtuvo la aprobación de los comités de ética departamentales, institucionales y locales (Proyecto n.º 674/2016BO2). Se recibió el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes antes…

Representative Results

Utilizando un dispositivo de corte de fabricación propia, pudimos explantar y generar pequeños discos de cartílago (4 mm x 1 mm) a partir de cóndilos humanos frescos que contenían un patrón espacial celularúnico 30 de cuerdas simples (SS, Figura 2A), cuerdas dobles (DS), grupos pequeños (SC), grupos grandes (BC; Figura 2A) y difusa (Figura 2B). En la Figura 3A se muestra …

Discussion

Al ser una enfermedad progresiva y multifactorial, la artrosis desencadena cambios estructurales y funcionales en el cartílago articular. A lo largo del curso de la artrosis, las alteraciones en las características mecánicas se acompañan de cambios estructurales y bioquímicos en la superficie del cartílago articular^27,31. Los eventos patológicos más tempranos que ocurren en la OA son la depleción de proteoglicanos junto con la disrupción de la red de co…

Materials

Amphotericin B	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1397-89-3
Atomic force microscop (AFM) head	CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	JPK00518
Biocompatible sample glue	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	H000033
Calcein AM	Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA	14948	Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging
Cantilever	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SAA-SPH-5UM	Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm,  geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius
Cartilage ctting device	Self-made	n/a	Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm
CDD camera integrated in the AFM	The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany	DFK 31BF03
CDD camera integrated in the fluorescence microscope	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	DFC3000G
Cryotome	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	CM3050S
Data Processing Software for the AFM	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	Version 5.0.86,  can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany	41966052
Fluorescence Microscope (Leica DMi8)	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	11889113
Glass block cantiliver holder	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SP-90-05	Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	F1315
Microscope glass slides	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS294775X50
Mounting medium With DAPI	ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany	50011	Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs  side view imaging
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P4333
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater)	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	T-05-0117
Scalpel	Feather Medical Products, Osaka, Japan	2023-01
Silicone Skirt	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent  medium condensation in the AFM head.
Statistical program – SPSS	IBM, Armonk, New York, USA	SPSS Statistics 22	Vesion 280.0.0.0 (190)
Tissue culture dishes	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	SA6255012	Water-soluble embedding medium