Att ta itu med praktiska frågor i atomkraftsmikroskopibaserad mikrointryckning på humant ledbroskexplantat

Summary

Vi presenterar ett steg-för-steg-tillvägagångssätt för att identifiera och ta itu med de vanligaste problemen i samband med mikrointryckningar i atomkraftsmikroskopi. Vi exemplifierar de framväxande problemen på naturliga mänskliga ledbroskexplantat som kännetecknas av olika grader av artrosdriven degeneration.

Abstract

Utan tvekan är atomkraftsmikroskopi (AFM) för närvarande en av de mest kraftfulla och användbara teknikerna för att bedöma mikro- och till och med nanosignaler inom det biologiska området. Men som med alla andra mikroskopiska metoder kan metodologiska utmaningar uppstå. I synnerhet kan egenskaperna hos provet, provberedningen, typen av instrument och intryckningssonden leda till oönskade artefakter. I detta protokoll exemplifierar vi dessa framväxande problem på friska såväl som osteoartritiska ledbroskexplantat. För detta ändamål visar vi först via en steg-för-steg-metod hur man genererar, graderar och visuellt klassificerar ex vivo ledbroskskivor enligt olika stadier av degeneration med hjälp av stor 2D-mosaikfluorescensavbildning av hela vävnadsexplantaten. Den största styrkan med ex vivo-modellen är att den består av åldrat, naturligt, humant brosk som gör det möjligt att undersöka artrosrelaterade förändringar från tidig debut till progression. Dessutom presenteras vanliga fallgropar vid vävnadspreparation, samt själva AFM-proceduren tillsammans med den efterföljande dataanalysen. Vi visar hur grundläggande men avgörande steg som provberedning och bearbetning, topografiska provegenskaper orsakade av avancerad degeneration och provspetsinteraktion kan påverka datainsamlingen. Vi granskar också de vanligaste problemen inom AFM och beskriver, där det är möjligt, hur man kan lösa dem. Kunskap om dessa begränsningar är av yttersta vikt för korrekt datainsamling, tolkning och i slutändan inbäddning av resultat i ett brett vetenskapligt sammanhang.

Introduction

På grund av den ständigt krympande storleken på elektroniska enheter och system har den snabba utvecklingen av mikro- och nanobaserad teknik och utrustning tagit fart. En sådan anordning är atomkraftsmikroskopi (AFM), som kan skanna biologiska ytor och hämta topografisk eller biomekanisk information på både nano- och mikrometerskala ^1,2. Bland dess stora funktioner kan detta verktyg användas som en mikro- såväl som en nanoindenter för att få information om de mekaniska egenskaperna hos olika biologiska system 3,4,5,6. Data samlas in genom fysisk kontakt med ytan genom en mekanisk sond, som kan vara så liten som cirka 1 nm vid spetsen⁷. Den resulterande deformationen av provet visas sedan baserat på intryckningsdjupet för den utskjutande spetsen och kraften som appliceras på provet⁸.

Artros (OA) är en långvarig degenerativ kronisk sjukdom som kännetecknas av försämring av ledbrosket i lederna och omgivande vävnader, vilket kan leda till fullständig exponering av benytorna. Bördan av OA är betydande; Idag lider hälften av alla kvinnor och en tredjedel av alla män över 65 år av artros⁹. Trauman, fetma och den resulterande förändrade biomekaniken i leden¹⁰ bestämmer ledbroskdegenerationen, vilket ses som ett vanligt slutresultat. Den banbrytande studien av Ganz et al. antog att de tidiga stegen i OA-processen kan involvera de biomekaniska egenskaperna hos brosk¹¹, och sedan dess har forskare bekräftat denna hypotes¹². På samma sätt är det allmänt accepterat att vävnadens biomekaniska egenskaper är funktionellt orkestrerade av den ultrastrukturella organisationen såväl som cell-cell och cell-matris överhörning. Eventuella förändringar kan dramatiskt påverka vävnadens övergripande biomekaniska funktion¹³. Hittills är artrosdiagnosen klinisk och baseras på vanlig filmröntgen¹⁴. Detta tillvägagångssätt är dubbelsidigt: för det första gör avsaknaden av en definierad degenerativ gränsvärde för att formulera diagnosen OA tillståndet svårt att kvantifiera, och för det andra saknar avbildningsmetoder känslighet och standardisering och kan inte upptäcka lokaliserade broskskador^15,16,17. För detta ändamål har bedömningen av broskets mekaniska egenskaper den avgörande fördelen att den beskriver en parameter som förändras under artrosförloppet oavsett sjukdomens etiologi och har en direkt inverkan på vävnadens funktionalitet i ett mycket tidigt skede. Intryckningsinstrument mäter den kraft med vilken vävnaden motstår intryckningen. Detta är i själva verket inget nytt koncept. De tidigaste studierna går tillbaka till 1980- och 1990-talen. Under denna period tyder många studier på att intryckningsinstrument utformade för artroskopiska mätningar av ledbrosk kan vara väl lämpade för att upptäcka degenerativa förändringar i brosket. Redan för 30 år sedan kunde vissa studier visa att intryckningsinstrument kunde detektera in vivo-förändringar i broskytan under vävnadsdegeneration genom att utföra tryckstyvhetsmätningar under artroskopi^18,19,20.

AFM-indrag (AFM-IT) av ledbrosket ger information om en central mekanisk egenskap hos vävnaden, nämligen styvhet. Detta är en mekanisk parameter som beskriver förhållandet mellan en applicerad, icke-destruktiv belastning och den resulterande deformationen av det indragna vävnadsområdet²¹. AFM-IT har visat sig kunna kvantifiera åldersberoende förändringar i styvhet i makroskopiskt opåverkade kollagennätverk, och därmed skilja mellan de patologiska förändringar som är förknippade med debut av artros (grad 0 på Outerbridge-skalan i ledbrosk)²². Vi har tidigare visat att AFM-ITs, på grundval av spatial kondrocytorganisation som en bildbaserad biomarkör för tidig broskdegeneration, inte bara möjliggör kvantifiering utan också faktiskt lokalisering av de tidigaste degenerativa mekaniska förändringarna. Dessa resultat har redan bekräftats av andra^23,24. Därför fungerar AFM-IT som ett intressant verktyg för att diagnostisera och identifiera tidiga degenerativa förändringar. Dessa förändringar kan redan mätas på cellnivå, vilket omformar förståelsen av den patofysiologiska processen för artros.

I detta protokoll demonstrerar vi en komplett histologisk och biomekanisk graderingsprocedur för ledbroskexplantat, från naturlig broskexplantation till AFM-datainsamling och bearbetning. Genom ett steg-för-steg-tillvägagångssätt visar vi hur man genererar, graderar och visuellt klassificerar ledbroskvävnad enligt olika stadier av degeneration med hjälp av 2D stor mosaikavbildning, följt av mikro-AFM-intryck.

Även om AFM-IT för närvarande är ett av de känsligaste verktygen för att mäta biomekaniska förändringar i brosk⁷, har det, precis som alla andra instrumentella tekniker, begränsningar och praktiska egenheter²⁵ som kan leda till felaktig datainsamling. För detta ändamål granskar vi de vanligaste problemen som uppstår vid AFM-mätningar av broskexplantat och beskriver, där det är möjligt, hur man kan minimera eller övervinna dem. Dessa inkluderar topografiska aspekter av proverna och svårigheterna att stabilisera dem i en AFM-kompatibel miljö, fysiska särdrag hos vävnadens yta och de resulterande svårigheterna att utföra AFM-mätningar på sådana ytor. Exempel på felaktiga kraft-avståndskurvor presenteras också, med betoning på de förhållanden som kan orsaka dem. Ytterligare begränsningar som är inneboende i geometrin hos den fribärande spetsen och användningen av Hertz-modellen för dataanalys diskuteras också.

Protocol

Lårbenskondyler som samlats in från patienter som genomgick total knäprotesplastik vid universitetssjukhuset i Tübingen, Tyskland, användes. Endast ledbroskprover från patienter med degenerativa och posttraumatiska ledpatologier inkluderades i denna studie. Godkännande från avdelnings-, institutions- och lokaletiska kommittéer erhölls innan studien påbörjades (projekt nr 674/2016BO2). Skriftligt informerat samtycke erhölls från alla patienter före deltagandet. OBS: Ett flödessc…

Representative Results

Med hjälp av en egentillverkad skäranordning kunde vi explantera och generera små (4 mm x 1 mm) broskskivor från färska mänskliga kondyler som innehåller ett enda cellulärt rumsligt mönster30 av enkla strängar (SS, figur 2A), dubbla strängar (DS), små kluster (SC), stora kluster (BC; (figur 2A) och diffus (figur 2B). En representativ broskexplantering visas i figur 3A…

Discussion

Som en progressiv och multifaktoriell sjukdom utlöser artros strukturella och funktionella förändringar i ledbrosket. Under hela artrosförloppet åtföljs försämringar av mekaniska egenskaper av strukturella och biokemiska förändringar på ledbroskets yta^27,31. De tidigaste patologiska händelserna som inträffar vid artros är proteoglykanutarmning i kombination med störning av kollagennätverket^32,33,34<sup class="xre…

Materials

Amphotericin B	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1397-89-3
Atomic force microscop (AFM) head	CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	JPK00518
Biocompatible sample glue	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	H000033
Calcein AM	Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA	14948	Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging
Cantilever	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SAA-SPH-5UM	Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm,  geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius
Cartilage ctting device	Self-made	n/a	Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm
CDD camera integrated in the AFM	The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany	DFK 31BF03
CDD camera integrated in the fluorescence microscope	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	DFC3000G
Cryotome	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	CM3050S
Data Processing Software for the AFM	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	Version 5.0.86,  can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany	41966052
Fluorescence Microscope (Leica DMi8)	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	11889113
Glass block cantiliver holder	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SP-90-05	Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	F1315
Microscope glass slides	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS294775X50
Mounting medium With DAPI	ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany	50011	Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs  side view imaging
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P4333
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater)	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	T-05-0117
Scalpel	Feather Medical Products, Osaka, Japan	2023-01
Silicone Skirt	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent  medium condensation in the AFM head.
Statistical program – SPSS	IBM, Armonk, New York, USA	SPSS Statistics 22	Vesion 280.0.0.0 (190)
Tissue culture dishes	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	SA6255012	Water-soluble embedding medium