Affrontare i problemi pratici nella microindentazione basata sulla microscopia a forza atomica su espianti di cartilagine articolare umana

Summary

Presentiamo un approccio passo-passo per identificare e affrontare i problemi più comuni associati alle micro-indentazioni di microscopia a forza atomica. Esemplificamo i problemi emergenti sugli espianti di cartilagine articolare umana nativa caratterizzati da vari gradi di degenerazione guidata dall’osteoartrite.

Abstract

Senza dubbio, la microscopia a forza atomica (AFM) è attualmente una delle tecniche più potenti e utili per valutare micro e persino nano-segnali in campo biologico. Tuttavia, come con qualsiasi altro approccio microscopico, possono sorgere sfide metodologiche. In particolare, le caratteristiche del campione, la preparazione del campione, il tipo di strumento e la sonda di indentazione possono portare ad artefatti indesiderati. In questo protocollo, esemplificamo questi problemi emergenti sugli espianti di cartilagine articolare sana e osteoartritica. A tal fine, mostriamo innanzitutto attraverso un approccio passo-passo come generare, classificare e classificare visivamente i dischi di cartilagine articolare ex vivo in base ai diversi stadi di degenerazione per mezzo di un grande imaging a fluorescenza a mosaico 2D dell’intero tessuto espianto. Il principale punto di forza del modello ex vivo è che comprende cartilagine umana invecchiata, nativa, che consente di studiare i cambiamenti correlati all’osteoartrite dall’esordio precoce alla progressione. Inoltre, vengono presentate anche le insidie comuni nella preparazione dei tessuti, nonché l’effettiva procedura AFM insieme alla successiva analisi dei dati. Mostriamo come le fasi di base ma cruciali come la preparazione e l’elaborazione del campione, le caratteristiche topografiche del campione causate dalla degenerazione avanzata e l’interazione campione-punta possano influire sull’acquisizione dei dati. Sottoponiamo inoltre ad esame i problemi più comuni nell’AFM e descriviamo, ove possibile, come superarli. La conoscenza di questi limiti è della massima importanza per la corretta acquisizione dei dati, l’interpretazione e, in ultima analisi, l’integrazione dei risultati in un ampio contesto scientifico.

Introduction

A causa delle dimensioni sempre più ridotte dei dispositivi e dei sistemi elettronici, il rapido sviluppo di tecnologie e apparecchiature a base di micro e nano ha guadagnato slancio. Uno di questi dispositivi è la microscopia a forza atomica (AFM), che può scansionare superfici biologiche e recuperare informazioni topografiche o biomeccaniche su scala nanometrica^e micrometrica ^1,2. Tra le sue vaste caratteristiche, questo strumento può essere utilizzato sia come micro che come nano-penetratore per ottenere informazioni sulle proprietà meccaniche di vari sistemi biologici 3,4,5,6. I dati vengono raccolti per contatto fisico con la superficie attraverso una sonda meccanica, che può essere piccola fino a circa 1 nm alla sua punta⁷. La deformazione risultante del campione viene quindi visualizzata in base alla profondità di indentazione della punta a sbalzo e alla forza applicata sul campione⁸.

L’osteoartrite (OA) è una malattia cronica degenerativa a lungo termine caratterizzata dal deterioramento della cartilagine articolare delle articolazioni e dei tessuti circostanti, che può portare alla completa esposizione delle superfici ossee. L’onere dell’OA è notevole; attualmente, la metà di tutte le donne e un terzo di tutti gli uomini di età pari o superiore a 65 anni soffrono di OA⁹. I traumi, l’obesità e la conseguente alterazione della biomeccanica dell’articolazione¹⁰ determinano la degenerazione della cartilagine articolare, che viene vista come un risultato finale comune. Lo studio pionieristico di Ganz et al. ha postulato che le prime fasi del processo OA possono coinvolgere le proprietà biomeccaniche della cartilagine¹¹, e da allora i ricercatori hanno confermato questa ipotesi¹². Allo stesso modo, è generalmente accettato che le proprietà biomeccaniche del tessuto siano funzionalmente orchestrate dall’organizzazione ultrastrutturale e dal crosstalk cellula-cellula e cellula-matrice. Qualsiasi alterazione può avere un impatto drammatico sul funzionamento biomeccanico complessivo del tessuto¹³. Ad oggi, la diagnosi di OA è clinica e si basa sulla radiografia a film semplice¹⁴. Questo approccio è duplice: in primo luogo, la mancanza di una soglia di cut-off degenerativa definita per formulare la diagnosi di OA rende la condizione difficile da quantificare e, in secondo luogo, i metodi di imaging mancano di sensibilità e standardizzazione e non possono rilevare danni localizzati alla cartilagine^15,16,17. A tal fine, la valutazione delle proprietà meccaniche della cartilagine ha il vantaggio decisivo di descrivere un parametro che cambia durante il decorso dell’OA indipendentemente dall’eziologia della malattia e ha un’influenza diretta sulla funzionalità tissutale in una fase molto precoce. Gli strumenti di indentazione misurano la forza con cui il tessuto resiste all’indentazione. Non si tratta, infatti, di un concetto nuovo; I primi studi risalgono agli anni ’80 e ’90. In questo periodo, numerosi studi hanno suggerito che gli strumenti di indentazione progettati per le misurazioni artroscopiche della cartilagine articolare potrebbero essere adatti per rilevare cambiamenti degenerativi nella cartilagine. Anche 30 anni fa, alcuni studi sono stati in grado di dimostrare che gli strumenti di indentazione erano in grado di rilevare in vivo i cambiamenti nella superficie della cartilagine durante la degenerazione tissutale conducendo misurazioni della rigidità a compressione durante l’artroscopia^18,19,20.

L’indentazione AFM (AFM-IT) della cartilagine articolare fornisce informazioni su una proprietà meccanica fondamentale del tessuto, vale a dire la rigidità. Si tratta di un parametro meccanico che descrive la relazione tra un carico non distruttivo applicato e la deformazione risultante dell’area del tessuto dentellata²¹. AFM-IT ha dimostrato di essere in grado di quantificare le modificazioni dipendenti dall’età nella rigidità nelle reti di collagene macroscopicamente non interessate, differenziando così tra i cambiamenti patologici associati all’insorgenza dell’OA (grado 0 sulla scala Outerbridge nella cartilagine articolare)²². In precedenza abbiamo dimostrato che gli AFM-IT, sulla base dell’organizzazione spaziale dei condrociti come biomarcatore basato su immagini per la degenerazione precoce della cartilagine, consentono non solo di quantificare ma anche di individuare effettivamente i primi cambiamenti meccanici degenerativi. Questi risultati sono già stati confermati da altri^23,24. Quindi, AFM-IT agisce come uno strumento interessante per diagnosticare e identificare i cambiamenti degenerativi precoci. Questi cambiamenti possono essere già misurati a livello cellulare, rimodellando la comprensione del processo fisiopatologico dell’OA.

In questo protocollo, dimostriamo una procedura completa di grading istologico e biomeccanico degli espianti di cartilagine articolare, dalla preparazione dell’espianto di cartilagine nativa all’acquisizione e all’elaborazione dei dati AFM. Attraverso un approccio passo-passo, mostriamo come generare, classificare e classificare visivamente il tessuto cartilagineo articolare in base alle diverse fasi di degenerazione per mezzo di imaging a mosaico di grandi dimensioni 2D, seguito da rientranze micro-AFM.

Anche se, attualmente, l’AFM-IT è uno degli strumenti più sensibili per misurare le alterazioni biomeccaniche della cartilagine⁷, come ogni altra tecnica strumentale, presenta limitazioni e peculiarità pratiche²⁵ che possono portare ad un’errata acquisizione dei dati. A tal fine, sottoponiamo ad esame i problemi più comuni che sorgono durante le misurazioni AFM degli espianti di cartilagine e descriviamo, ove possibile, come minimizzarli o superarli. Questi includono gli aspetti topografici dei campioni e le difficoltà di stabilizzarli in un ambiente compatibile con l’AFM, le peculiarità fisiche della superficie del tessuto e le conseguenti difficoltà nell’eseguire misurazioni AFM su tali superfici. Vengono anche presentati esempi di curve forza-distanza errate, sottolineando le condizioni che possono causarle. Vengono inoltre discusse ulteriori limitazioni inerenti alla geometria della punta a sbalzo e all’uso del modello Hertz per l’analisi dei dati.

Protocol

Sono stati utilizzati condili femorali prelevati da pazienti sottoposti ad artroplastica totale del ginocchio presso l’ospedale universitario di Tubinga, in Germania. In questo studio sono stati inclusi solo campioni di cartilagine articolare di pazienti con patologie articolari degenerative e post-traumatiche. Prima dell’inizio dello studio è stata ottenuta l’approvazione del comitato etico dipartimentale, istituzionale e locale (Progetto n.674/2016BO2). Il consenso informato scritto è stato ricevuto da tutti i pazien…

Representative Results

Utilizzando un dispositivo di taglio autocostruito, siamo stati in grado di espiantare e generare piccoli dischi di cartilagine (4 mm x 1 mm) da condili umani freschi contenenti un singolo modello spaziale cellulare30 di singole stringhe (SS, Figura 2A), doppie stringhe (DS), piccoli cluster (SC), grandi cluster (BC; Figura 2A) e diffusa (Figura 2B). Un espianto di cartilagine rappresentativo è raffigurato n…

Discussion

Essendo una malattia progressiva e multifattoriale, l’OA innesca cambiamenti strutturali e funzionali nella cartilagine articolare. Durante il decorso dell’OA, le compromissioni delle caratteristiche meccaniche sono accompagnate da cambiamenti strutturali e biochimici sulla superficie della cartilagine articolare^27,31. I primi eventi patologici che si verificano nell’OA sono la deplezione dei proteoglicani accoppiata con l’interruzione della rete di collagene<sup…

Materials

Amphotericin B	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1397-89-3
Atomic force microscop (AFM) head	CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	JPK00518
Biocompatible sample glue	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	H000033
Calcein AM	Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA	14948	Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging
Cantilever	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SAA-SPH-5UM	Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm,  geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius
Cartilage ctting device	Self-made	n/a	Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm
CDD camera integrated in the AFM	The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany	DFK 31BF03
CDD camera integrated in the fluorescence microscope	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	DFC3000G
Cryotome	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	CM3050S
Data Processing Software for the AFM	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	Version 5.0.86,  can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany	41966052
Fluorescence Microscope (Leica DMi8)	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	11889113
Glass block cantiliver holder	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SP-90-05	Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	F1315
Microscope glass slides	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS294775X50
Mounting medium With DAPI	ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany	50011	Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs  side view imaging
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P4333
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater)	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	T-05-0117
Scalpel	Feather Medical Products, Osaka, Japan	2023-01
Silicone Skirt	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent  medium condensation in the AFM head.
Statistical program – SPSS	IBM, Armonk, New York, USA	SPSS Statistics 22	Vesion 280.0.0.0 (190)
Tissue culture dishes	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	SA6255012	Water-soluble embedding medium