Животная модель рыбок данио-рерио для изучения аллергических реакций в ответ на биомолекулы слюны клеща

Summary

Здесь рыбки данио-рерио (Danio rerio) используются в качестве модели для изучения аллергических реакций и иммунных реакций, связанных с синдромом альфа-Гал (AGS), путем оценки аллергических реакций на слюну клещей и потребление мяса млекопитающих.

Abstract

Клещи являются членистоногими переносчиками, которые вызывают заболевание путем передачи патогенов и чьи укусы могут быть связаны с аллергическими реакциями, влияющими на здоровье человека во всем мире. У некоторых людей высокие уровни антител иммуноглобулина Е против гликана Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) были вызваны укусами клещей. Анафилактические реакции, опосредованные гликопротеинами и гликолипидами, содержащими гликан α-Gal, присутствующий в слюне клеща, связаны с синдромом альфа-Гала (AGS) или аллергией на мясо млекопитающих. Рыбки данио-рерио (Danio rerio) стали широко используемой моделью позвоночных для изучения различных патологий. В этом исследовании рыбки данио-рерио использовались в качестве модели для изучения аллергических реакций в ответ на потребление α-Gal и мяса млекопитающих, поскольку, как и люди, они не синтезируют этот гликан. С этой целью оценивали поведенческие паттерны и геморрагические аллергические реакции анафилактического типа в ответ на слюну клеща Ixodes ricinus и потребление мяса млекопитающими. Этот экспериментальный подход позволяет получить достоверные данные, подтверждающие животную модель рыбок данио, для изучения клещевой аллергии, включая AGS.

Introduction

Клещи являются переносчиками патогенов, вызывающих заболевания, а также являются причиной аллергических реакций, влияющих на здоровье людей и животных во всем мире ^1,2. Во время кормления клещей биомолекулы в слюне клеща, особенно белки и липиды, облегчают питание этих эктопаразитов, избегая защиты хозяина³. Некоторые биомолекулы слюны с модификациями гликана Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) приводят к выработке высоких уровней антител IgE против α-Gal после укуса клеща только у некоторых людей, что известно как синдром α-Gal (AGS)⁴. Это заболевание, связанное с IgE-опосредованной аллергией, которая может привести к анафилаксии к укусам клещей, потреблению мяса млекопитающих, не приматов, и некоторым лекарствам, таким как цетуксимаб⁵. Реакции на α-Gal часто бывают тяжелыми и иногда могут привести к летальному исходу 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

α-Gal встречается у всех млекопитающих, за исключением обезьян Старого Света, человекообразных обезьян и людей, которые не обладают способностью синтезировать α-Gal¹³. Однако патогены, такие как бактерии и простейшие, экспрессируют этот гликан на своей поверхности, что может индуцировать выработку большого количества антител IgM/IgG против α-Gal и может быть защитным механизмом против этих патогенов^16,17. Однако выработка антител против α-Gal увеличивает риск развития IgE-опосредованной аллергии на α-Gal ^7,13. Естественные антитела к α-Gal, продуцируемые в организме человека, в основном подтипов IgM/IgG, могут быть связаны с этой модификацией, присутствующей в бактериях из микробиоты^{кишечника 16}. АГС может быть сложным клиническим диагнозом, поскольку основной диагностический метод в настоящее время основан на истории болезни отсроченных аллергических реакций, особенно связанных с пищевой аллергией (т.е. зудом, локализованной крапивницей или рецидивирующим ангионевротическим отеком до анафилаксии, крапивницы и желудочно-кишечных симптомов) и измерением уровней антител IgE к α-Gal⁹. Текущие данные свидетельствуют о том, что укусы клещей представляют собой один из основных рисков при появлении АГС 18,19, 20-кратное или более повышение уровня IgE до α-Gal после укуса клеща 19, укусы клещей в анамнезе у пациентов с АГС^20,21,22, наличие антител, реагирующих на клещевые антигены у пациентов с АГС ^19, и что анти-α-Gal IgE тесно связаны с уровнями антиклещевого IgE^19,23, но необходимы дальнейшие исследования, чтобы оценить^, какие биомолекулы на самом деле участвуют.

Кроме того, другим возможным сценарием являются пациенты, которые проявляют сильные аллергические реакции на укусы клещей и высокий уровень антител IgE к α-Gal, но толерантны к потреблению мяса млекопитающих¹². Таким образом, аллергия на мясо млекопитающих может быть особым типом аллергии, связанной с укусом клеща. Основные виды клещей, ассоциированные с AGS, включают Amblyomma americanum (США), Amblyomma sculptum (Бразилия), Amblyomma testudinarium и Haemaphysalis longicornis (Япония), Ixodes holocyclus ( Австралия) и Ixodes ricinus (основной переносчик боррелиоза Лайма в Европе)^11,24.

Единственной моделью, которая использовалась для оценки продукции IgE, связанной с укусами клещей, является мышиная модель, генетически модифицированная геном для мышей с нокаутом α-1,3-галактозилтрансферазы (α-Gal KO)^{мышей 25,26}, потому что, как и другие млекопитающие^, мыши также экспрессируют α-Gal на белках и липидах и не продуцируют IgE к α-Gal. Тем не менее, рыбка данио-рерио (Danio rerio) является полезной моделью для биомедицинских исследований, применяемых к млекопитающим, потому что она имеет много анатомических сходств с млекопитающими и, как и люди, также не может синтезировать α-Gal. Поскольку α-Gal не вырабатывается естественным образом у рыбок данио, это доступная модель, которой легко манипулировать, и она позволяет использовать большой размер выборки для изучения аллергических реакций, связанных с α-Gal.

В этом исследовании рыбки данио-рерио используются в качестве модельного организма для характеристики и описания местных аллергических реакций, поведенческих паттернов и молекулярных механизмов, связанных с реакцией на чрескожную сенсибилизацию к слюне клещей^26,27 и последующее потребление мяса млекопитающими. С этой целью рыб подвергают воздействию клещевой слюны путем внутрикожной инъекции, а затем кормят кормом для собак, который содержит продукты мясного происхождения млекопитающих, пригодные для использования животными, которые содержат α-Gal²⁷, затем оцениваются возможные связанные с этим аллергические реакции. Этот метод может быть применен для изучения других биомолекул, связанных с аллергическими процессами, особенно связанных с АГС.

Protocol

Все методы, описанные здесь, были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных Университета Кастилии-Ла-Манча в рамках исследования «Оценка иммунного ответа на инактивированную вакцину M. bovis и вызов M. marinum у рыбок данио-рерио номер модели PR-2017-05-12». Клещ…

Representative Results

Представленный здесь протокол основан на нескольких аспектах ранее опубликованных экспериментов27,30 и результатах, выполненных в нашей лаборатории, где модель рыбок данио-рерио установлена и проверена для изучения AGS и иммунного ответа на α-Gal, поскольку…

Discussion

Рыбки данио-рерио – это экономичная и простая в обращении модель, которая также является очень эффективным инструментом для изучения молекулярных механизмов иммунного ответа, патогенных заболеваний, тестирования новых лекарств, а также вакцинации и защиты от инфекций^{33,34,35</sup…}

Materials

1.5 mL tube	VWR	525-0990
All Prep DNA/RNA	Qiagen	80284
Aquatics facilities
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
Disection set	VWR	631-1279
Dog Food – Red Classic	Acana
ELISA plates-96 well	Thermo Fisher Scientific	10547781
Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal)	Dextra	NGP0203
iScript Reverse Transcription Supermix	Supermix	1708840
Microliter syringes	Hamilton	7638-01
Plate reader	any
Phosphate buffered saline	Sigma	P4417-50TAB
pilocarpine hydrochloride	Sigma	P6503
Pipette tip P10	VWR	613-0364
Pipette tip P1000	VWR	613-0359
Premium food tropical fish	DAPC
Sponge Animal Holder			Made from scrap foam
Stereomicroscope	any
Thermal Cycler Real-Time PCR	any
Tricaine methanesulphonate (MS-222)	Sigma	E10521