Modello animale di zebrafish per lo studio delle reazioni allergiche in risposta alle biomolecole della saliva delle zecche
Summary
Qui, il pesce zebra (Danio rerio) viene utilizzato come modello per studiare le reazioni allergiche e le risposte immunitarie correlate alla sindrome alfa-Gal (AGS) valutando le reazioni allergiche alla saliva delle zecche e al consumo di carne di mammifero.
Abstract
Le zecche sono vettori di artropodi che causano malattie per trasmissione di agenti patogeni e le cui punture potrebbero essere correlate a reazioni allergiche che hanno un impatto sulla salute umana in tutto il mondo. In alcuni individui, alti livelli di anticorpi immunoglobuline E contro il glicano Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) sono stati indotti da punture di zecca. Le reazioni anafilattiche mediate da glicoproteine e glicolipidi contenenti il glicano α-Gal, presente nella saliva delle zecche, sono correlate alla sindrome alfa-Gal (AGS) o all’allergia alla carne di mammifero. Il pesce zebra (Danio rerio) è diventato un modello di vertebrati ampiamente utilizzato per lo studio di diverse patologie. In questo studio, il pesce zebra è stato utilizzato come modello per lo studio delle reazioni allergiche in risposta al consumo di carne di α-Gal e di mammifero perché, come gli esseri umani, non sintetizzano questo glicano. A tale scopo, sono stati valutati i modelli comportamentali e le reazioni allergiche di tipo anafilattico emorragico in risposta alla saliva della zecca Ixodes ricinus e al consumo di carne di mammifero. Questo approccio sperimentale consente di ottenere dati validi che supportano il modello animale zebrafish per lo studio delle allergie trasmesse dalle zecche incluso AGS.
Introduction
Le zecche sono vettori di agenti patogeni che causano malattie e sono anche la causa di reazioni allergiche, che influenzano la salute degli esseri umani e degli animali in tutto il mondo 1,2. Durante l’alimentazione delle zecche, le biomolecole nella saliva delle zecche, in particolare proteine e lipidi, facilitano l’alimentazione di questi ectoparassiti, evitando le difese dell’ospite3. Alcune biomolecole di saliva con glicani Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) modificano la produzione di alti livelli di anticorpi anti-α-Gal IgE dopo la puntura di zecca, solo in alcuni individui, che è noto come sindrome α-Gal (AGS)4. Questa è una malattia associata all’allergia IgE-mediata che può causare anafilassi alle punture di zecca, consumo di carne di mammifero non primate e alcuni farmaci come cetuximab5. Le reazioni a α-Gal sono spesso gravi e talvolta possono essere fatali 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Il α-Gal si trova in tutti i mammiferi ad eccezione delle scimmie del Vecchio Mondo, delle scimmie e degli esseri umani che non hanno la capacità di sintetizzare α-Gal13. Tuttavia, agenti patogeni come batteri e protozoi esprimono questo glicano sulla loro superficie, che può indurre la produzione di elevate quantità di anticorpi anti-α-Gal IgM/IgG e può essere un meccanismo protettivo contro questi patogeni16,17. Tuttavia, la produzione di anticorpi anti-α-Gal aumenta il rischio di sviluppare allergie anti-α-Gal mediate da IgE 7,13. Gli anticorpi anti-α-Gal naturali prodotti nell’uomo, principalmente dei sottotipi IgM/IgG, potrebbero essere associati a questa modificazione presente nei batteri del microbiota intestinale16. L’AGS può essere una diagnosi clinica impegnativa, poiché il principale metodo diagnostico al momento si basa su una storia clinica di reazioni allergiche ritardate, in particolare associate ad allergie alimentari (cioè prurito, orticaria localizzata o angioedema ricorrente ad anafilassi, orticaria e sintomi gastrointestinali) e la misurazione dei livelli di anticorpi anti-α-Gal IgE9. I risultati attuali suggeriscono che le punture di zecca costituiscono uno dei principali rischi nella comparsa di AGS 18,19, un aumento di 20 volte o più dei livelli di IgE a α-Gal a seguito di una puntura di zecca 19, una storia di punture di zecca in pazienti con AGS20,21,22, l’esistenza di anticorpi reattivi agli antigeni delle zecche nei pazienti AGS 19, e che le IgE anti-α-Gal sono fortemente correlate ai livelli di IgE anti-zecca19,23, ma sono necessari ulteriori studi per valutare quali biomolecole sono effettivamente coinvolte.
Inoltre, un altro scenario possibile sono i pazienti che presentano forti reazioni allergiche alle punture di zecca e alti livelli di anticorpi anti-α-Gal IgE, ma sono tolleranti al consumo di carne di mammifero12. Pertanto, l’allergia alla carne di mammifero potrebbe essere un particolare tipo di allergia correlata al morso di zecca. Le principali specie di zecche associate all’AGS includono Amblyomma americanum (USA), Amblyomma sculptum (Brasile), Amblyomma testudinarium e Haemaphysalis longicornis (Giappone), Ixodes holocyclus (Australia) e Ixodes ricinus (il principale vettore della borreliosi di Lyme in Europa)11,24.
L’unico modello che è stato utilizzato per valutare la produzione di IgE correlata alle punture di zecca è il modello murino geneticamente modificato con il gene per topi α-1,3-galattosiltransferasi knocked out (α-Gal KO)25,26 perché, come altri mammiferi, i topi esprimono anche α-Gal su proteine e lipidi e non producono IgE in α-Gal. Tuttavia, il pesce zebra (Danio rerio) è un modello utile per la ricerca biomedica applicata ai mammiferi perché condivide molte somiglianze anatomiche con i mammiferi e, come gli umani, non è anche in grado di sintetizzare α-Gal. Poiché α-Gal non è prodotto naturalmente nel pesce zebra, è un modello economico, facile da manipolare e consente un’elevata dimensione del campione per lo studio delle reazioni allergiche correlate al α-Gal.
In questo studio, il pesce zebra viene utilizzato come organismo modello per caratterizzare e descrivere le reazioni allergiche locali, i modelli comportamentali e i meccanismi molecolari associati alla risposta alla sensibilizzazione percutanea alla saliva delle zecche26,27 e al successivo consumo di carne di mammifero. A tale scopo, i pesci vengono esposti alla saliva delle zecche mediante iniezione intradermica e quindi vengono nutriti con mangimi per cani, che contengono prodotti derivati dalla carne di mammifero adatti all’uso animale che contengono α-Gal27, quindi vengono valutate eventuali reazioni allergiche correlate. Questo metodo può essere applicato allo studio di altre biomolecole correlate ai processi allergici, in particolare quelli correlati all’AGS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il pesce zebra è un modello economico e facile da maneggiare che è stato anche uno strumento molto fattibile per lo studio dei meccanismi molecolari della risposta immunitaria, delle malattie patogene, dei nuovi test farmacologici, della vaccinazione e della protezione contro le infezioni33,34,35. Lo studio sul comportamento del pesce zebra è utile poiché studi precedenti hanno scoperto che alcune specie di pesci rimangono i…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare i membri del gruppo SaBio per la loro collaborazione nella progettazione sperimentale e l’assistenza tecnica con l’impianto sperimentale del pesce e Juan Galcerán Sáez (IN-CSIC-UMH, Spagna) per aver fornito il pesce zebra. Questo lavoro è stato sostenuto da Ministerio de Ciencia e Innovación/Agencia Estatal de Investigación MCIN/AEI/10.13039/501100011033, Spagna e EU-FEDER (Grant BIOGAL PID2020-116761GB-I00). Marinela Contreras è finanziata dal Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Spagna, sovvenzione IJC2020-042710-I.
Materials
| 1.5 mL tube | VWR | 525-0990 | |
| All Prep DNA/RNA | Qiagen | 80284 | |
| Aquatics facilities | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Disection set | VWR | 631-1279 | |
| Dog Food – Red Classic | Acana | ||
| ELISA plates-96 well | Thermo Fisher Scientific | 10547781 | |
| Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) | Dextra | NGP0203 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Supermix | 1708840 | |
| Microliter syringes | Hamilton | 7638-01 | |
| Plate reader | any | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-50TAB | |
| pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| Pipette tip P10 | VWR | 613-0364 | |
| Pipette tip P1000 | VWR | 613-0359 | |
| Premium food tropical fish | DAPC | ||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| Stereomicroscope | any | ||
| Thermal Cycler Real-Time PCR | any | ||
| Tricaine methanesulphonate (MS-222) | Sigma | E10521 |
Referências
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