Отслеживание индуцированного биспецифическими антителами трафика Т-клеток с использованием Т-клеток человека, трансдуцированных люциферазой
Summary
Здесь мы описываем метод трансдукции Т-клеток человека люциферазой для облегчения отслеживания in vivo индуцированного биспецифическими антителами транспорта Т-клеток к опухолям в исследованиях для оценки противоопухолевой эффективности и механизма биспецифических антител, вовлекающих Т-клетки.
Abstract
Биспецифические антитела, вовлекающие Т-клетки (T-BsAbs), находятся на различных стадиях доклинической разработки и клинических испытаний на солидные опухоли. Такие факторы, как валентность, пространственное расположение, междоменное расстояние и мутации Fc, влияют на противоопухолевую эффективность этих методов лечения, обычно влияя на самонахождение Т-клеток в опухолях, что остается серьезной проблемой. Здесь мы описываем метод трансдукции активированных Т-клеток человека люциферазой, позволяющий in vivo отслеживать Т-клетки во время исследований терапии T-BsAb. Способность T-BsAb перенаправлять Т-клетки на опухоли может быть количественно оценена в несколько моментов времени во время лечения, что позволяет исследователям коррелировать противоопухолевую эффективность T-BsAbs и других вмешательств с персистенцией Т-клеток в опухолях. Этот метод избавляет от необходимости приносить в жертву животных во время лечения для гистологической оценки инфильтрации Т-клеток и может повторяться в несколько моментов времени для определения кинетики торговли Т-клетками во время и после лечения.
Introduction
Биспецифические антитела, вовлекающие Т-клетки (T-BsAbs), представляют собой сконструированные антитела, используемые для обеспечения искусственной специфичности к поликлональным Т-клеткам путем вовлечения Т-клеток через одно связывающее плечо и опухолевого антигена через другое связывающее звено. Эта технология была успешно применена к гематологическим раковым заболеваниям (блинатумомаб1, нацеленный на CD19), и многочисленные T-BsAb находятся в доклинической и клинической разработке для различных солидных опухолей2. T-BsAb вовлекают поликлональные Т-клетки независимым от основного комплекса гистосовместимости (MHC) образом, и поэтому даже опухоли, которые подавляют лейкоцитарные антигены человека (HLA), восприимчивы к этому типу терапии 3,4. T-BsAb были разработаны в десятках различных форматов, с различиями в валентности и пространственном расположении плеч связывания Т-клеток и опухоли, междоменных расстояниях и включении Fc-домена, который влияет на период полувыведения и может индуцировать эффекторные функции, если они присутствуют5. Предыдущая работа в нашей лаборатории показала, что эти факторы значительно влияют на противоопухолевую эффективность T-BsAbs, с 1000-кратными различиями в потенции6. В ходе этой работы мы определили формат IgG-[L]-scFv как идеальную платформу для T-BsAb (см. Раздел «Репрезентативные результаты» для получения более подробной информации о форматах T-BsAb) и применили эту платформу к мишеням, включая GD2 (нейробластома), HER2 (рак молочной железы и остеосаркома), GPA33 (колоректальный рак), STEAP1 (саркома Юинга), CD19 (злокачественные новообразования В-клеток) и CD33 (злокачественные новообразования В-клеток)7, 8,9,10,11,12,13.
Одной из основных проблем для успешного внедрения терапии T-BsAb в солидных опухолях является преодоление иммуносупрессивного микроокружения опухоли (TME) для стимулирования транспортировки Т-клеток к опухолям14. Факторы, влияющие на эффективность T-BsAb, описанные выше, оказывают значительное влияние на способность T-BsAb эффективно индуцировать самонаведение Т-клеток к опухолям, но этот эффект трудно оценить в системе in vivo в режиме реального времени. Эта рукопись содержит подробное описание использования трансдуцированных люциферазой Т-клеток в доклинических исследованиях T-BsAb для оценки трафика Т-клеток в различные ткани на экспериментальных моделях мышей с ослабленным иммунитетом во время лечения. Общая цель этого метода состоит в том, чтобы предоставить средства для оценки инфильтрации Т-клеток в опухолях и других тканях, а также понимание кинетики и персистенции Т-клеток в режиме реального времени без необходимости приносить в жертву животных во время лечения. Для растущего числа исследователей, специализирующихся на клеточной иммунотерапии, способность отслеживать Т-клетки in vivo на доклинических моделях животных имеет решающее значение. Мы стремимся предоставить тщательное, подробное описание метода, который мы использовали для отслеживания Т-клеток, трансдуцированных люциферазой, чтобы другие исследователи могли легко воспроизвести этот метод.
Protocol
Representative Results
Discussion
В то время как B-BsAb блинатумомаб был одобрен для CD19-положительных гематологических злокачественных новообразований, успешное внедрение T-BsAb в солидных опухолях оказалось гораздо более трудным. Катумаксомаб, T-BsAb, направленный против молекулы адгезии эпителиальных клеток (EPCAM), был одобр…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить доктора Владимира Пономарева за то, что он поделился конструкциями люциферазы, используемыми в экспериментах, описанных в разделе репрезентативных результатов этой статьи.
Materials
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7030-10G | |
| CD3/CD28 beads | Gibco (ThermoFisher) | 11161D | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DMEM | Gibco (ThermoFisher) | 11965092 | |
| DNA in vitro transfection reagent (polyjet) | SignaGen Laboratories | SL100688 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| FBS | Gibco (ThermoFisher) | 10437028 | |
| Gag/pol plasmid | Addgene | 14887 | |
| GFP plasmid | Addgene | 11150-DNA.cg | |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco (ThermoFisher) | 15140122 | |
| Recombinant human IL-2 | R&D Systems | 202-IL-010/CF | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Trypsin | Gibco (ThermoFisher) | 25-300-120 | |
| VSV-G plasmid | Addgene | 8454 |
Referências
- Gökbuget, N., et al. Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).
- Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24 (1), 50 (2018).
- Dreier, T., et al. T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct. The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).
- Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells. Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).
- Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy. Frontiers in Oncology. 10, 628005 (2020).
- Santich, B. H., et al. Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies. Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315 (2020).
- Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency. Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).
- Park, J. A., Cheung, N. V. GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 172 (2020).
- Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers. Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).
- Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114 (2021).
- Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626 (2020).
- Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia. Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).
- Hoseini, S. S., et al. T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509 (2021).
- Li, H., Er Saw, P., Song, E. Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics. Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).
- Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).
- Kleeman, B., et al. A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap. Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).
- Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222 (2021).
- Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 142 (2021).
- Ströhlein, M. A., Heiss, M. M. The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis. Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).
- Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).
- Skovgard, M. S., et al. Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications. Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).
