Dispositif de thérapie photodynamique construit en interne et à base de diodes électroluminescentes pour améliorer la cytotoxicité des vertéporfines dans un modèle de culture cellulaire 2D

Summary

Ici, nous décrivons un dispositif nouveau, simple et peu coûteux pour effectuer avec succès des tests de thérapie photodynamique in vitro (PDT) en utilisant une culture cellulaire HeLa bidimensionnelle et une vertéporfine comme photosensibilisant.

Abstract

Cet article décrit un dispositif nouveau, simple et peu coûteux pour effectuer des tests de thérapie photodynamique in vitro (PDT), appelé PhotoACT. Le dispositif a été construit à l’aide d’un ensemble de diodes électroluminescentes programmables (LED) conventionnelles, d’un module d’affichage à cristaux liquides (LCD) et d’un capteur de lumière connecté à une carte de microcontrôleur commerciale. La structure à base de boîte du prototype a été réalisée avec des panneaux de fibres de densité moyenne (MDF). Le compartiment interne peut attribuer simultanément quatre microplaques multipuits de culture cellulaire.

Comme preuve de concept, nous avons étudié l’effet cytotoxique de la vertéporfine photosensibilisante (PS) contre la lignée cellulaire HeLa en culture bidimensionnelle (2D). Les cellules HeLa ont été traitées avec des concentrations croissantes de vertéporfine pendant 24 heures. Le milieu surnageant contenant du médicament a été jeté, les cellules adhérentes ont été lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et un milieu sans médicament a été ajouté. Dans cette étude, l’effet de la vertéporfine sur les cellules a été examiné soit sans exposition à la lumière, soit après une exposition de 1 h à la lumière en utilisant des valeurs rouge-vert-bleu (RVB) de 255, 255 et 255 (fluence moyenne de 49,1 ± 0,6 J / cm²). Après 24 h, la viabilité cellulaire a été évaluée par le dosage du bromure de 3-(4,5-diméthyl-2-thiazolyl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT).

Les résultats expérimentaux ont montré que l’exposition des cellules traitées à la vertéporfine à la lumière du dispositif renforce l’effet cytotoxique du médicament via un mécanisme médié par les espèces réactives de l’oxygène (ROS). De plus, l’utilisation du prototype décrit dans ce travail a été validée en comparant les résultats avec un dispositif PDT commercial. Ainsi, ce prototype de thérapie photodynamique à base de LED représente une bonne alternative pour les études in vitro de la PDT.

Introduction

Parmi les maladies non transmissibles les plus mortelles, le cancer est l’une des principales causes mondiales de décès prématuré. Il a représenté près de 10 millions de décès en 2020, soit environ un décès sur six dans le monde¹. De plus, le phénomène de multirésistance (MDR) représente une menace considérable pour la santé publique, car les protocoles chimiothérapeutiques approuvés n’atteignent pas les stades de rémission pour cette condition clinique². Les cellules cancéreuses peuvent développer une résistance à la chimiothérapie par plusieurs mécanismes; cependant, la surexpression de certains transporteurs de cassettes de liaison à l’ATP (ABC) – les pompes à efflux dépendantes de l’ATP – est considérée comme la principale cause du développement de MDR dans un microenvironnement tumoral³. En plus de la MDR, d’autres complications du cancer, telles que la récidive et les métastases, renforcent la demande urgente de développer et d’améliorer des approches thérapeutiques pour surmonter ce défi oncologique.

L’utilisation curative de la lumière est pratiquée depuis des siècles⁴, et la thérapie photodynamique (PDT) représente une approche thérapeutique cliniquement approuvée pour les tumeurs solides. La PDT combine l’administration d’un photosensibilisateur (PS) suivie d’une irradiation lumineuse pour générer des espèces réactives de l’oxygène (ROS) afin d’exercer une cytotoxicité sélective dans les cellules tumorales. Cette approche thérapeutique est supérieure aux méthodes conventionnelles, y compris la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie⁵; Il s’agit d’une technique mini-invasive montrant une cytotoxicité plus faible dans les tissus conjonctifs⁶. L’application de lumière et l’accumulation de PS directement dans la tumeur ou son microenvironnement assurent un ciblage précis et, par conséquent, des effets secondaires systémiques mineurs et indésirables^{7 et} la possibilité de traitements répétés sur le même site. De plus, le coût est inférieur à celui des autres approches. En raison de ses caractéristiques prometteuses, la PDT peut être considérée comme une option appropriée à la fois pour les tumeurs uniques, en particulier dans le cas de tumeurs inopérables, ou pour le traitement adjuvant du cancer⁷, et représente une alternative à la MDR liée à la chimiothérapie ^8,9.

Le premier rapport montrant un taux de réponse objective élevé à l’aide de la PDT a été décrit en 1975 dans un modèle¹⁰ de souris et de rats. Depuis lors, des études ont été menées en utilisant la PDT avec des résultats positifs⁷ à la fois in vivo et in vitro avec des lignées cellulaires tumorales humaines en culture cellulaire^{2D 11,12}. Compte tenu de la large applicabilité de la PS cliniquement approuvée, quelles que soient leurs voies d’accumulation spécifiques et leurs gammes de longueurs d’onde des pics d’absorption, le processus général est le suivant: (i) absorption du PS, (ii) pic de concentration de PS à la tumeur ou à son microenvironnement, (iii) application de lumière, (iv) interaction PS-lumière, (v) transfert de l’énergie PS excitée à l’état d’excitation PS au substrat tissulaire ou aux molécules d’oxygène environnantes, (vi) la production de ROS impliquant de l’oxygène singulet ou de l’anion superoxyde, (vii) la mort des cellules tumorales via, essentiellement, la nécrose ou l’apoptose (mort directe), l’autophagie (mécanisme cytoprotecteur), l’ischémie tissulaire (lésions vasculaires), la modulation immunitaire ou un chevauchement de ces mécanismes⁷. Dans cette dernière étape, l’activation d’une voie de mort cellulaire spécifique dépend de nombreux facteurs, tels que les caractéristiques cellulaires, la conception expérimentale et, surtout, la localisation intracellulaire PS et les dommages ciblés liés à la PDT¹³.

La vertéporfine est un PS de deuxième génération, approuvé par les organismes de réglementation pour une utilisation clinique en Norvège et en Chine pour traiter la dégénérescence maculaire liée à l’âge⁷. Après l’administration de la dose, il a été rapporté que cette prodrogue s’accumulait partiellement dans les mitochondries¹⁴ et induisait la phosphorylation de la protéine cellulaire tyrosine et la fragmentation de l’ADN, conduisant à l’apoptose des cellules tumorales^15,16. Après 24 h d’incubation pour l’internalisation des vertéporfines, un protocole PDT utilisant une configuration de longueur d’onde de 690 nm est recommandé pour atteindre des niveaux efficaces de transfert de rayonnement électromagnétique aux molécules adjacentes ^7,17.

En ce qui concerne la source lumineuse pour PDT, les systèmes laser à diodes classiques sont généralement coûteux, techniquement compliqués, surdimensionnés, et donc non portables^18,19. En raison de son profil de longueur d’onde unique, qui peut également être observé dans les équipements PDT à base de LED, la demande d’unités indépendantes pour chaque application de photosensibilisateur rend l’utilisation de systèmes laser à diodes encore plus complexe et économiquement irréalisable^20,21. Par conséquent, l’utilisation de machines LED est considérée comme l’alternative la plus prometteuse pour résoudre non seulement les coûts²² et les problèmes de maintenance, mais aussi pour fournir une puissance de sortie élevée et une capacité d’éclairage moins nocive 23 et plus large 24,25,26,27.

Malgré la contribution potentielle que l’équipement à base de LED peut offrir aux expériences PDT²⁸, la plupart des options commerciales présentent encore des inconvénients tels qu’un manque de portabilité, des coûts élevés et des projets de construction et d’exploitation^{complexes 29}. L’objectif principal de ce travail était d’offrir un outil simple et fiable pour les tests PDT in vitro . Cet article décrit PhotoACT, un appareil PDT à LED construit en interne, qui est peu coûteux, convivial et portable. En tant que preuve de concept, il a été démontré que ce dispositif améliore la cytotoxicité de la vertéporfine dans un modèle de culture cellulaire 2D et, par conséquent, peut être utilisé comme outil de recherche dans les expériences PDT.

Protocol

REMARQUE : Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et logiciels utilisés dans ce protocole. 1. Construction de l’appareil Scie des panneaux de fibres de densité moyenne (MDF) de 3 mm d’épaisseur pour obtenir des pièces dont les dimensions sont indiquées à la figure 1A.Remarque : Utilisez le fichier vectoriel (fichier supplémentaire 1) po…

Representative Results

Le dernier dispositif PDT, nommé PhotoACT, comprenait une chambre sombre pour attribuer jusqu’à quatre microplaques multipuits, avec sa surface intérieure supérieure équipée d’un ensemble de 30 LED dispersées programmées pour émettre des spectres distincts de lumière visible (Figure 3 et Fichier supplémentaire 6). Le dispositif a été construit à l’aide de deux boîtiers associés : un boîtier interne conçu comme une chambre sombre pour les tests PDT, et…

Discussion

Le dernier appareil PhotoACT était pratique à construire avec des composants disponibles dans le commerce et à faible coût à un coût total inférieur à 50 $. Les avantages supplémentaires incluent de faibles exigences d’entretien, la capacité d’irradier plusieurs types de plaques de culture, l’utilisation simultanée de jusqu’à quatre unités par essai, un faible poids (2 kg)/taille (44 cm³) qui permet la portabilité, une irradiation précise et reproductible (données non présentées) et u…

Materials

0.5% Trypsin-EDTA (10x)	Gibco	15400054	Mammalian cell culture dissociation reagent
3D printer	Flashforge		Finder model
96-well plates			Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture
Arduino
Brightness sensor			TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface
Buttons
Buzzer
Cell culture Flasks			Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes)
Centrifuge Tubes			Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay
CO2 Incubator
Controller board			ESP32
Design Software	Trimble		SketchUp
DMEM High Glucose	Gibco	11965092	DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells.
DMSO	Sigma-Aldrich	D4540-500ML	Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture
Fetal Bovine Serum	Gibco	12657029	FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages.
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15750060	Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination
Hemocytometer			Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay
Inverted Laboratory Microscope	Leica		DM IL LED
Laminar Flow Hood			Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures
LCD display
LED RGB WS2812			5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts
MDF fiberboards			3mm thickness medium-density fiberboards
Microcentrifuge Tubes			Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay
Microplate reader	ThermoFischer		Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation.
MTT Reagent	Invitrogen	M6494	3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays
Operational System	Real Time Engineers ltd.		FreeRTOS
P10 micripipette			Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity
P1000 micropipette			Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity
P200 micropipette			Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity
PDT Equipment	LumaCare		Model LC-122
Phosphate-Buffered Saline pH 7.4	Gibco	10010031	Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures
Potentiometers
Tips			Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes
Verteporfin	Sigma-Aldrich	SML0534-5MG	Verteporfin, ≥94% (HPLC)