Ein selbst gebautes photodynamisches Therapiegerät auf Basis von Leuchtdioden zur Verbesserung der Verteporfin-Zytotoxizität in einem 2D-Zellkulturmodell

Summary

Hier beschreiben wir ein neuartiges, einfaches und kostengünstiges Gerät zur erfolgreichen Durchführung von In-vitro-Tests der photodynamischen Therapie (PDT) unter Verwendung zweidimensionaler HeLa-Zellkultur und Verteporfin als Photosensibilisator.

Abstract

Dieser Artikel beschreibt ein neuartiges, einfaches und kostengünstiges Gerät zur Durchführung von In-vitro-Tests der photodynamischen Therapie (PDT), das PhotoACT genannt wird. Das Gerät wurde mit einem Satz herkömmlicher programmierbarer Leuchtdioden (LEDs), einem LCD-Modul (Liquid Crystal Display) und einem Lichtsensor gebaut, der an eine kommerzielle Mikrocontrollerplatine angeschlossen ist. Die kastenbasierte Struktur des Prototyps wurde mit mitteldichten Faserplatten (MDFs) hergestellt. Das interne Kompartiment kann gleichzeitig vier Zellkultur-Multiwell-Mikroplatten zuordnen.

Als Proof of Concept untersuchten wir die zytotoxische Wirkung des Photosensibilisators (PS) Verteporfin gegen die HeLa-Zelllinie in zweidimensionaler (2D) Kultur. HeLa-Zellen wurden 24 h lang mit steigenden Konzentrationen von Verteporfin behandelt. Das arzneimittelhaltige Überstandsmedium wurde verworfen, die adhärenten Zellen wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und medikamentenfreies Medium hinzugefügt. In dieser Studie wurde die Wirkung von Verteporfin auf Zellen entweder ohne Lichtexposition oder nach 1-stündiger Lichtexposition anhand von Rot-Grün-Blau (RGB) Werten von 255, 255 und 255 (durchschnittliche Fluenz von 49,1 ± 0,6 J/cm²) untersucht. Nach 24 h wurde die Zelllebensfähigkeit mit dem 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay beurteilt.

Experimentelle Ergebnisse zeigten, dass die Exposition von mit Verteporfin behandelten Zellen gegenüber dem Licht des Geräts die zytotoxische Wirkung des Arzneimittels über einen Mechanismus verstärkt, der durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) vermittelt wird. Darüber hinaus wurde die Verwendung des in dieser Arbeit beschriebenen Prototyps validiert, indem die Ergebnisse mit einem kommerziellen PDT-Gerät verglichen wurden. Somit stellt dieser LED-basierte photodynamische Therapieprototyp eine gute Alternative für in vitro Studien der PDT dar.

Introduction

Unter den tödlichsten nichtübertragbaren Krankheiten ist Krebs eine weltweit häufigste Ursache für vorzeitige Todesfälle. Im Jahr 2020 entfielen fast 10 Millionen Todesfälle, was etwa einem von sechs Todesfällen weltweit entspricht¹. Darüber hinaus stellt das Phänomen der Multidrug-Resistenz (MDR) eine enorme Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar, da zugelassene chemotherapeutische Protokolle für diesen klinischen Zustand keine Remissionsstadien erreichen². Krebszellen können durch mehrere Mechanismen eine Resistenz gegen Chemotherapie entwickeln; Die Überexpression einiger ATP-bindender Kassettentransporter (ABC) – ATP-abhängige Effluxpumpen – gilt jedoch als Hauptursache für die MDR-Entwicklung innerhalb einer Tumormikroumgebung³. Neben der MDR verstärken andere Krebskomplikationen wie Rezidive und Metastasen die dringende Notwendigkeit, therapeutische Ansätze zur Bewältigung dieser onkologischen Herausforderung zu entwickeln und zu verbessern.

Die kurative Nutzung von Licht wird seit Jahrhunderten^{praktiziert 4}, und die photodynamische Therapie (PDT) stellt einen klinisch anerkannten Therapieansatz für solide Tumore dar. Die PDT kombiniert die Verabreichung eines Photosensibilisators (PS), gefolgt von Lichtbestrahlung, um reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zu erzeugen, um selektive Zytotoxizität in Tumorzellen auszuüben. Dieser therapeutische Ansatz ist herkömmlichen Methoden wie Operation, Bestrahlung und Chemotherapie überlegen⁵; Es handelt sich um eine minimalinvasive Technik, die eine geringere Zytotoxizität im Bindegewebe aufweist⁶. Die Lichtapplikation und die PS-Akkumulation direkt im Tumor oder seiner Mikroumgebung gewährleisten ein präzises Targeting und folglich geringe, unerwünschte systemische Nebenwirkungen⁷ und die Möglichkeit einer wiederholten Behandlung an derselben Stelle. Darüber hinaus sind die Kosten niedriger als bei anderen Ansätzen. Aufgrund ihrer vielversprechenden Eigenschaften kann die PDT als geeignete Option sowohl für die einzelne, insbesondere bei inoperablen Tumoren, als auch für die adjuvante Krebsbehandlung⁷ angesehen werden und stellt eine Alternative für MDR im Zusammenhang mit der Chemotherapie^{dar 8,9}.

Der erste Bericht, der eine hohe objektive Ansprechrate unter Verwendung der PDT zeigte, wurde 1975 in einem Maus- und Rattenmodell¹⁰ beschrieben. Seitdem wurden Studien mit PDT mit positiven Ergebnissen⁷ sowohl in vivo als auch in vitro mit menschlichen Tumorzelllinien de 2D-Zellkultur^{durchgeführt 11,12}. Unter Berücksichtigung der breiten Anwendbarkeit klinisch zugelassener PS, unabhängig von ihren spezifischen Akkumulationswegen und Wellenlängenbereichen der Absorptionspeaks, ist der allgemeine Prozess wie folgt: (i) PS-Aufnahme, (ii) Spitzenwert der PS-Konzentration am Tumor oder seiner Mikroumgebung, (iii) Lichtanwendung, (iv) PS-Licht-Wechselwirkung, (v) Übertragung von PS-angeregter Energie entweder auf Gewebesubstrat oder umgebende Sauerstoffmoleküle, (vi) ROS-Produktion mit Singulett-Sauerstoff oder Superoxid-Anion, (vii) Tumorzelltod durch im Wesentlichen Nekrose oder Apoptose (direkter Tod), Autophagie (zytoprotektiver Mechanismus), Gewebeischämie (Gefäßschäden), Immunmodulation oder eine Überlappung dieser Mechanismen⁷. In diesem letzten Stadium hängt die Aktivierung eines spezifischen Zelltodwegs von vielen Faktoren ab, wie Zelleigenschaften, experimentellem Design und vor allem PS-intrazellulärer Lokalisation und PDT-bedingten gezielten Schäden¹³.

Verteporfin ist ein PS der zweiten Generation, das von Zulassungsbehörden für den klinischen Einsatz in Norwegen und China zur Behandlung der altersbedingten Makuladegeneration⁷ zugelassen wurde. Nach Dosisabgabe wurde berichtet, dass sich dieses Prodrug teilweise in Mitochondrien^{anreichert 14} und zelluläre Proteintyrosinphosphorylierung und DNA-Fragmentierung induziert, was zu einer Tumorzellapoptose^{führt 15,16}. Nach 24-stündiger Inkubation zur Verteporfin-Internalisierung wird ein PDT-Protokoll unter Verwendung eines Wellenlängenaufbaus von 690 nm empfohlen, um eine effektive elektromagnetische Strahlungsübertragung auf benachbarte Moleküle ^7,17 zu erreichen.

Was die Lichtquelle für PDT betrifft, so sind die klassischen Diodenlasersysteme in der Regel teuer, technisch kompliziert, überdimensioniert und daher nicht portabel^18,19. Aufgrund seines Single-Wellenlängen-Profils, das auch in LED-basierten PDT-Geräten beobachtet werden kann, macht die Nachfrage nach unabhängigen Einheiten für jede Photosensibilisator-Anwendung den Einsatz von Diodenlasersystemen noch komplexer und wirtschaftlich nicht realisierbar^20,21. Daher gilt die Verwendung von LED-Maschinen als die vielversprechendste Alternative, um nicht nur Kosten 22 und Wartungsprobleme zu lösen, sondern auch eine hohe Leistung und weniger schädliche²³ und eine breitere Beleuchtungsfähigkeit^24,25,26,27 bereitzustellen.

Trotz des potenziellen Beitrags, den LED-basierte Geräte zu PDT-Experimenten leisten können²⁸, weisen die meisten kommerziellen Optionen immer noch Nachteile auf, wie mangelnde Portabilität, hohe Kosten und komplexe Bauprojekte und Betrieb²⁹. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, ein einfaches und zuverlässiges Werkzeug für In-vitro-PDT-Assays anzubieten. Dieses Dokument beschreibt PhotoACT, ein selbst gebautes LED-basiertes PDT-Gerät, das kostengünstig, benutzerfreundlich und tragbar ist. Als Machbarkeitsnachweis wird gezeigt, dass dieses Gerät die Zytotoxizität von Verteporfin in einem 2D-Zellkulturmodell verbessert und daher als Forschungswerkzeug in PDT-Experimenten verwendet werden kann.

Protocol

HINWEIS: Details zu allen Materialien, Reagenzien und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle . 1. Geräteaufbau Sägen Sie 3 mm dicke mitteldichte Faserplatten (MDF), um Teile mit den in Abbildung 1A gezeigten Abmessungen zu erhalten.HINWEIS: Verwenden Sie die Vektordatei (Supplemental File 1) für CNC-Schneiden. Bauen Sie zwei Boxen mit den fo…

Representative Results

Das letzte PDT-Gerät mit dem Namen PhotoACT enthielt eine dunkle Kammer zur Zuweisung von bis zu vier Multiwell-Mikrotiterplatten, wobei die obere Innenfläche mit einem Satz von 30 gestreuten LEDs ausgestattet war, die so programmiert waren, dass sie unterschiedliche Spektren sichtbaren Lichts emittieren (Abbildung 3 und Zusatzdatei 6). Das Gerät bestand aus zwei zugehörigen Boxen: einer internen Box, die als dunkle Kammer für die PDT-Assays konzipiert war, und einer ex…

Discussion

Das endgültige PhotoACT-Gerät war bequem mit kommerziell erhältlichen, kostengünstigen Komponenten zu Gesamtkosten von weniger als 50 US-Dollar zu konstruieren. Weitere Vorteile sind ein geringer Wartungsaufwand, die Fähigkeit, mehrere Arten von Kulturplatten zu bestrahlen, die gleichzeitige Verwendung von bis zu vier Einheiten pro Assay, ein geringes Gewicht (2 kg)/Größe (44 cm³), das Portabilität, genaue und reproduzierbare Bestrahlung (Daten nicht gezeigt) ermöglicht, und eine benutzerfreundliche u…

Materials

0.5% Trypsin-EDTA (10x)	Gibco	15400054	Mammalian cell culture dissociation reagent
3D printer	Flashforge		Finder model
96-well plates			Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture
Arduino
Brightness sensor			TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface
Buttons
Buzzer
Cell culture Flasks			Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes)
Centrifuge Tubes			Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay
CO2 Incubator
Controller board			ESP32
Design Software	Trimble		SketchUp
DMEM High Glucose	Gibco	11965092	DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells.
DMSO	Sigma-Aldrich	D4540-500ML	Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture
Fetal Bovine Serum	Gibco	12657029	FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages.
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15750060	Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination
Hemocytometer			Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay
Inverted Laboratory Microscope	Leica		DM IL LED
Laminar Flow Hood			Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures
LCD display
LED RGB WS2812			5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts
MDF fiberboards			3mm thickness medium-density fiberboards
Microcentrifuge Tubes			Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay
Microplate reader	ThermoFischer		Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation.
MTT Reagent	Invitrogen	M6494	3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays
Operational System	Real Time Engineers ltd.		FreeRTOS
P10 micripipette			Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity
P1000 micropipette			Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity
P200 micropipette			Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity
PDT Equipment	LumaCare		Model LC-122
Phosphate-Buffered Saline pH 7.4	Gibco	10010031	Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures
Potentiometers
Tips			Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes
Verteporfin	Sigma-Aldrich	SML0534-5MG	Verteporfin, ≥94% (HPLC)