מכשיר טיפול פוטודינמי מבוסס דיודה פולטת אור הבנוי בתוך הבית להגברת ציטוטוקסיות של חוליות במודל תרבית תאים דו-ממדית

Summary

כאן אנו מתארים מכשיר חדשני, פשוט ובעלות נמוכה לביצוע מוצלח של מבחני טיפול פוטודינמי במבחנה (PDT) תוך שימוש בתרבית תאי HeLa דו-ממדית וורטפורפין כפוטוסנסיטייזר.

Abstract

מאמר זה מתאר מכשיר חדשני, פשוט ובעלות נמוכה לביצוע מבחני טיפול פוטודינמי במבחנה (PDT), בשם PhotoACT. ההתקן נבנה באמצעות מערך של דיודות פולטות אור (LED) קונבנציונליות הניתנות לתכנות, מודול תצוגת גביש נוזלי (LCD) וחיישן אור המחובר ללוח מיקרו-בקרים מסחרי. המבנה מבוסס התיבה של אב הטיפוס נעשה עם סיבית בצפיפות בינונית (MDFs). התא הפנימי יכול להקצות בו זמנית ארבעה מיקרו-לוחות מרובי תרביות תאים.

כהוכחת היתכנות, חקרנו את ההשפעה הציטוטוקסית של הפוטוסנסיטייזר (PS) verteporfin כנגד קו תאי HeLa בתרבית דו-ממדית (2D). תאי HeLa טופלו בריכוזים הולכים וגדלים של verteporfin במשך 24 שעות. המדיום העל-טבעי המכיל את התרופה הושלך, התאים הדבקים נשטפו בתמיסת מלח עם אגירת פוספטים (PBS), ונוסף מדיום ללא תרופות. במחקר זה נבדקה ההשפעה של ורטפורפין על תאים ללא חשיפה לאור או לאחר חשיפה של שעה אחת לאור באמצעות ערכי אדום-ירוק-כחול (RGB) של 255, 255 ו-255 (פלואנס ממוצע של 49.1 ± 0.6 J/cm²). לאחר 24 שעות, כדאיות התא הוערכה על ידי בדיקת 3-(4,5-דימתיל-2-תיאזוליל)-2,5-דיפנילטטרזוליום ברומיד (MTT).

תוצאות הניסוי הראו כי חשיפה של תאים שטופלו עם verteporfin לאור מהמכשיר מגבירה את ההשפעה הציטוטוקסית של התרופה באמצעות מנגנון המתווך על ידי מיני חמצן תגובתי (ROS). בנוסף, השימוש באב הטיפוס המתואר בעבודה זו אומת על ידי השוואת התוצאות עם מכשיר PDT מסחרי. לפיכך, אב טיפוס זה של טיפול פוטודינמי מבוסס LED מייצג אלטרנטיבה טובה למחקרים חוץ גופיים של PDT.

Introduction

בין המחלות הקטלניות ביותר שאינן ניתנות לתקשורת, סרטן מהווה גורם מוביל בעולם למוות בטרם עת. הוא היווה כמעט 10 מיליון מקרי מוות בשנת 2020, המייצגים בערך אחד מכל שישה מקרי מוות ברחבי העולם¹. בנוסף, תופעת העמידות למולטי-דרוג (MDR) מהווה איום עצום על בריאות הציבור, שכן פרוטוקולים כימותרפיים מאושרים אינם מצליחים להגיע לשלבי הפוגה עבור מצב קליני זה². תאים סרטניים יכולים לפתח עמידות לכימותרפיה באמצעות מספר מנגנונים; עם זאת, ביטוי יתר של כמה מובילי קלטות מחייבות ATP (ABC) – משאבות efflux תלויות ATP – נחשב הגורם העיקרי להתפתחות MDR בתוך מיקרו-סביבה של גידול³. בנוסף ל- MDR, סיבוכי סרטן אחרים, כגון הישנות וגרורות, מחזקים את הדרישה הדחופה לפתח ולשפר גישות טיפוליות כדי להתגבר על אתגר אונקולוגי זה.

הניצול המרפא של האור היה נהוג במשך מאות^שנים, וטיפול פוטודינמי (PDT) מייצג גישה טיפולית מאושרת קלינית לגידולים מוצקים. PDT משלב מתן של פוטו-סנסיטייזר (PS) ואחריו קרינת אור כדי ליצור מיני חמצן תגובתי (ROS) כדי להפעיל ציטוטוקסיות סלקטיבית בתאי הגידול. גישה טיפולית זו עדיפה על השיטות הקונבנציונליות, הכוללות ניתוח, הקרנות וכימותרפיה⁵; זוהי טכניקה זעיר פולשנית המציגה ציטוטוקסיות נמוכה יותר ברקמות חיבור⁶. יישום האור והצטברות PS ישירות בגידול או במיקרו-סביבה שלו מבטיחים מיקוד מדויק, וכתוצאה מכך, תופעות לוואי מערכתיות קלות ובלתי רצויות⁷ ואפשרות לטיפול חוזר באותו אתר. יתר על כן, העלות נמוכה מזו של גישות אחרות. בשל התכונות המבטיחות שלה, PDT יכול להיחשב אופציה מתאימה עבור שניהם יחיד, במיוחד במקרה של גידולים שאינם ניתנים לניתוח, או טיפול בסרטן אדג’ובנטי⁷, ומייצג חלופה ל- MDR הקשורה לכימותרפיה ^8,9.

הדו”ח הראשון שהראה שיעור תגובה אובייקטיבי גבוה באמצעות PDT תואר בשנת 1975 במודל¹⁰ של עכבר וחולדה. מאז, נערכו מחקרים באמצעות PDT עם תוצאות חיוביות⁷ הן in vivo והן in vitro עם קווי תאים סרטניים אנושיים בתרבית תאים דו-ממדית^11,12. בהתחשב בתחולה הרחבה של PS שאושר קלינית, ללא קשר למסלולי ההצטברות הספציפיים שלהם ולטווחי אורכי הגל של פסגות הבליעה, התהליך הכללי הוא כדלקמן: (i) ספיגת PS, (ii) שיא של ריכוז PS בגידול או במיקרו-סביבה שלו, (iii) יישום אור, (iv) אינטראקציה PS-light, (v) העברת אנרגיה במצב התרגשות PS למצע רקמה או למולקולות חמצן הסובבות אותם, (vi) ייצור ROS הכולל חמצן סינגלט או אניון סופראוקסיד, (vii) מוות של תאי גידול באמצעות, למעשה, נמק או אפופטוזיס (מוות ישיר), אוטופגיה (מנגנון ציטופרוטקטיבי), איסכמיה של רקמות (נזק לכלי הדם), אפנון חיסוני, או חפיפה של מנגנונים אלה⁷. בשלב סופי זה, ההפעלה של מסלול מוות תאי מסוים תלויה בגורמים רבים, כגון מאפייני התא, תכנון ניסוי, והכי חשוב, לוקליזציה תוך-תאית של PS ונזק ממוקד הקשור ל-PDT¹³.

Verteporfin הוא דור שני של PS, שאושר על ידי סוכנויות רגולטוריות לשימוש קליני בנורווגיה ובסין לטיפול בניוון מקולרי הקשור לגיל⁷. לאחר מתן המינון, דווח כי פרודרוג זה מצטבר באופן חלקי במיטוכונדריה¹⁴ וגורם לזרחון חלבון תאי טירוזין ולפיצול DNA, מה שמוביל לאפופטוזיס של תאי הגידול^15,16. לאחר דגירה של 24 שעות להפנמת ורטפורפין, מומלץ פרוטוקול PDT המשתמש במערך אורך גל של 690 ננומטר כדי להשיג רמות יעילות של העברת קרינה אלקטרומגנטית למולקולות סמוכות ^7,17.

לגבי מקור האור עבור PDT, מערכות הלייזר הדיודה הקלאסיות הן בדרך כלל יקרות, מסובכות מבחינה טכנית, גדולות מדי, ולכן^18,19 שאינן ניתנות להעברה. כתוצאה מפרופיל אורך הגל היחיד שלו, שניתן לצפות בו גם בציוד PDT מבוסס LED, הדרישה ליחידות עצמאיות עבור כל יישום פוטו-סנסיטייזר הופכת את השימוש במערכות לייזר דיודה למורכב עוד יותר ובלתי ישים מבחינה כלכלית^20,21. לכן, השימוש במכונות LED נחשב לחלופה המבטיחה ביותר לפתרון לא רק עלויות²² ובעיות תחזוקה, אלא גם לספק תפוקת הספק גבוהה ופחות מזיקה 23 ויכולת תאורה רחבה יותר 24,25,26,27.

למרות התרומה הפוטנציאלית שציוד מבוסס LED יכול להציע לניסויי PDT²⁸, לרוב האפשרויות המסחריות עדיין יש חסרונות כגון היעדר ניידות, עלות גבוהה ופרויקטי בנייה מורכבים ותפעול²⁹. המטרה העיקרית של עבודה זו הייתה להציע כלי פשוט ואמין עבור מבחני PDT במבחנה . מאמר זה מתאר את PhotoACT, התקן PDT מבוסס LED שנבנה בתוך החברה, שהוא זול, ידידותי למשתמש ונייד. כהוכחת היתכנות, מכשיר זה הוכח כמגביר את הציטוטוקסיות של ורטפורפין במודל תרבית תאים דו-ממדית, ולכן יכול לשמש ככלי מחקר בניסויי PDT.

Protocol

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והתוכנות המשמשים בפרוטוקול זה. 1. בניית מכשירים ראה לוחות סיבית בעובי 3 מ”מ בצפיפות בינונית (MDF) כדי לקבל חלקים עם הממדים המוצגים באיור 1A.הערה: השתמש בקובץ הווקטורי (<s…

Representative Results

מכשיר ה-PDT הסופי, שנקרא PhotoACT, כלל תא כהה להקצאת עד ארבעה מיקרו-לוחות מרובי משתתפים, כאשר המשטח הפנימי העליון שלו מצויד בקבוצה של 30 נורות LED מפוזרות המתוכנתות לפלוט ספקטרום שונה של אור נראה (איור 3 וקובץ משלים 6). המכשיר נבנה באמצעות שתי תיבות משויכות: קופסה פנימית שתוכ…

Discussion

מכשיר PhotoACT הסופי היה נוח לבנייה עם רכיבים זמינים מסחרית בעלות נמוכה בעלות כוללת של פחות מ-$50. יתרונות נוספים כוללים דרישות תחזוקה נמוכות, יכולת להקרין סוגים רבים של לוחות תרבית, שימוש בו זמנית של עד ארבע יחידות לכל בדיקה, משקל נמוך (2 ק”ג)/גודל (44 ס”מ³) המאפשר ניידות, הקרנה מדויקת וניתנת ל?…

Materials

0.5% Trypsin-EDTA (10x)	Gibco	15400054	Mammalian cell culture dissociation reagent
3D printer	Flashforge		Finder model
96-well plates			Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture
Arduino
Brightness sensor			TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface
Buttons
Buzzer
Cell culture Flasks			Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes)
Centrifuge Tubes			Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay
CO2 Incubator
Controller board			ESP32
Design Software	Trimble		SketchUp
DMEM High Glucose	Gibco	11965092	DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells.
DMSO	Sigma-Aldrich	D4540-500ML	Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture
Fetal Bovine Serum	Gibco	12657029	FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages.
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15750060	Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination
Hemocytometer			Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay
Inverted Laboratory Microscope	Leica		DM IL LED
Laminar Flow Hood			Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures
LCD display
LED RGB WS2812			5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts
MDF fiberboards			3mm thickness medium-density fiberboards
Microcentrifuge Tubes			Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay
Microplate reader	ThermoFischer		Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation.
MTT Reagent	Invitrogen	M6494	3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays
Operational System	Real Time Engineers ltd.		FreeRTOS
P10 micripipette			Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity
P1000 micropipette			Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity
P200 micropipette			Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity
PDT Equipment	LumaCare		Model LC-122
Phosphate-Buffered Saline pH 7.4	Gibco	10010031	Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures
Potentiometers
Tips			Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes
Verteporfin	Sigma-Aldrich	SML0534-5MG	Verteporfin, ≥94% (HPLC)