Et internt bygget og lysemitterende diodebasert fotodynamisk behandlingsapparat for å forbedre verteporfincytotoksisitet i en 2D-cellekulturmodell

Summary

Her beskriver vi en ny, enkel og rimelig enhet for å kunne utføre in vitro fotodynamisk terapi (PDT) analyser ved hjelp av todimensjonal HeLa-cellekultur og verteporfin som fotosensibilisator.

Abstract

Dette papiret beskriver en ny, enkel og rimelig enhet for å utføre in vitro fotodynamisk terapi (PDT) analyser, kalt PhotoACT. Enheten ble bygget ved hjelp av et sett med konvensjonelle programmerbare lysdioder (LED), en LCD-modul (Liquid Crystal Display) og en lyssensor koblet til et kommersielt mikrokontrollerkort. Den boksbaserte strukturen til prototypen ble laget med fiberplater med middels tetthet (MDF). Det indre rommet kan samtidig tildele fire cellekultur multiwell mikroplater.

Som et bevis på konseptet studerte vi den cytotoksiske effekten av fotosensibilisatoren (PS) verteporfin mot HeLa-cellelinjen i todimensjonal (2D) kultur. HeLa-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av verteporfin i 24 timer. Det medikamentholdige supernatantmediet ble kassert, de tilhørende cellene ble vasket med fosfatbufret saltvann (PBS), og medikamentfritt medium ble tilsatt. I denne studien ble effekten av verteporfin på celler undersøkt enten uten lyseksponering eller etter eksponering i 1 time for lys ved bruk av rød-grønn-blå (RGB) verdier på 255, 255 og 255 (gjennomsnittlig flyt på 49,1 ± 0,6 J / cm²). Etter 24 timer ble cellens levedyktighet vurdert ved 3-(4,5-dimetyl-2-tiazolyl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse.

Eksperimentelle resultater viste at eksponering av celler behandlet med verteporfin til lyset fra enheten forbedrer stoffets cytotoksiske effekt via en mekanisme mediert av reaktive oksygenarter (ROS). I tillegg ble bruken av prototypen beskrevet i dette arbeidet validert ved å sammenligne resultatene med en kommersiell PDT-enhet. Dermed representerer denne LED-baserte fotodynamiske terapiprototypen et godt alternativ for in vitro-studier av PDT.

Introduction

Blant de mest dødelige ikke-smittsomme sykdommene representerer kreft en global ledende årsak til tidlig død. Den sto for nesten 10 millioner dødsfall i 2020, som representerer om lag ett av seks dødsfall på verdensbasis¹. I tillegg representerer fenomenet multiresistens (MDR) en enorm folkehelsetrussel, da godkjente kjemoterapeutiske protokoller ikke når remisjonsstadier for denne kliniske tilstanden². Kreftceller kan utvikle motstand mot kjemoterapi gjennom flere mekanismer; Imidlertid anses overekspresjonen av noen ATP-bindende kassetttransportører (ABC) – ATP-avhengige efflukspumper – som hovedårsaken til MDR-utvikling i et tumormikromiljø³. I tillegg til MDR forsterker andre kreftkomplikasjoner, som tilbakefall og metastase, det presserende behovet for å utvikle og forbedre terapeutiske tilnærminger for å overvinne denne onkologiske utfordringen.

Den kurative utnyttelsen av lys har blitt praktisert i århundrer⁴, og fotodynamisk terapi (PDT) representerer en klinisk godkjent terapeutisk tilnærming for solide svulster. PDT kombinerer administrering av en fotosensibilisator (PS) etterfulgt av lysbestråling for å generere reaktive oksygenarter (ROS) for å utøve selektiv cytotoksisitet i tumorceller. Denne terapeutiske tilnærmingen er bedre enn konvensjonelle metoder, inkludert kirurgi, stråling og kjemoterapi⁵; Det er en minimal invasiv teknikk som viser lavere cytotoksisitet i bindevev⁶. Lysapplikasjonen og PS-akkumuleringen direkte i svulsten eller dens mikromiljø sikrer presis målretting og følgelig mindre, uønskede systemiske bivirkninger⁷ og muligheten for gjentatt behandling på samme sted. Videre er kostnaden lavere enn for andre tilnærminger. På grunn av sine lovende egenskaper kan PDT betraktes som et passende alternativ for både enkelt, spesielt i tilfelle av inoperable svulster, eller adjuvant kreftbehandling⁷, og representerer et alternativ for MDR relatert til kjemoterapi ^8,9.

Den første rapporten som viste høy objektiv responsrate ved bruk av PDT ble beskrevet i 1975 i en muse- og rottemodell¹⁰. Siden da har studier blitt utført ved bruk av PDT med positive resultater⁷ både in vivo og in vitro med humane tumorcellelinjer i 2D-cellekultur^11,12. Tatt i betraktning den brede anvendeligheten av klinisk godkjent PS, uavhengig av deres spesifikke akkumuleringsveier og bølgelengdeområder av absorpsjonstopper, er den generelle prosessen som følger: (i) PS-opptak, (ii) topping av PS-konsentrasjon ved svulsten eller dens mikromiljø, (iii) lysapplikasjon, (iv) PS-lysinteraksjon, (v) overføring av PS-opphisset tilstandsenergi til enten vevssubstrat eller omkringliggende oksygenmolekyler, (vi) ROS-produksjon som involverer singlet oksygen eller superoksidanion, (vii) tumorcelledød via hovedsakelig nekrose eller apoptose (direkte død), autofagi (cytobeskyttende mekanisme), vevsiskemi (vaskulær skade), immunmodulering eller overlapping av disse mekanismene⁷. I dette siste stadiet avhenger aktiveringen av en spesifikk celledødsvei av mange faktorer, for eksempel celleegenskaper, eksperimentell design og, viktigst, PS intracellulær lokalisering og PDT-relatert målrettet skade¹³.

Verteporfin er en andregenerasjons PS, godkjent av tilsynsorganer for klinisk bruk i Norge og Kina for å behandle aldersrelatert makuladegenerasjon⁷. Etter doselevering ble dette prodruget delvis akkumulert i mitokondrier¹⁴ og indusere cellulær proteintyrosinfosforylering og DNA-fragmentering, noe som førte til tumorcelleapoptose^15,16. Etter 24 timers inkubasjon for verteporfin-internalisering anbefales en PDT-protokoll ved bruk av et 690 nm bølgelengdeoppsett for å oppnå effektive nivåer av elektromagnetisk strålingsoverføring til tilstøtende molekyler ^7,17.

Når det gjelder lyskilden for PDT, er de klassiske diodelasersystemene vanligvis dyre, teknisk kompliserte, store og dermed ubærbare^18,19. Som en konsekvens av sin enkeltbølgelengdeprofil, som også kan observeres i LED-basert PDT-utstyr, gjør etterspørselen etter uavhengige enheter for hver fotosensibiliseringsapplikasjon utnyttelsen av diodelasersystemer enda mer kompleks og økonomisk umulig^20,21. Derfor anses bruken av LED-maskiner som det mest lovende alternativet for å løse ikke bare kostnader²² og vedlikeholdsproblemer, men også for å gi høy effekt og mindre skadelig 23 og bredere belysningsevne^24,25,26,27.

Til tross for det potensielle bidraget som LED-basert utstyr kan tilby til PDT-eksperimenter²⁸, har de fleste kommersielle alternativer fortsatt ulemper som mangel på bærbarhet, høye kostnader og komplekse byggeprosjekter og drift²⁹. Hovedmålet med dette arbeidet var å tilby et enkelt og pålitelig verktøy for in vitro PDT-analyser. Dette papiret beskriver PhotoACT, en egenbygd LED-basert PDT-enhet, som er billig, brukervennlig og bærbar. Som et bevis på konseptet er denne enheten vist å forbedre cytotoksisiteten til verteporfin i en 2D-cellekulturmodell og kan derfor brukes som et forskningsverktøy i PDT-eksperimenter.

Protocol

MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer, reagenser og programvare som brukes i denne protokollen. 1. Enhetens konstruksjon Sag 3 mm tykke middels tetthet fiberplater (MDF) for å oppnå stykker med dimensjonene vist i figur 1A.MERK: Bruk vektorfilen (tilleggsfil 1) til cnc-skjæring (numerisk kontroll). Bygg to bokser med følgende dimensjoner (lengde x bredd…

Representative Results

Den endelige PDT-enheten, kalt PhotoACT, inkluderte et mørkt kammer for å tildele opptil fire multiwell mikroplater, med sin øvre indre overflate utstyrt med et sett med 30 spredte lysdioder programmert til å avgi forskjellige spektrum av synlig lys (figur 3 og tilleggsfil 6). Enheten ble bygget ved hjelp av to tilhørende bokser: en intern boks designet som et mørkt kammer for PDT-analysene, og en ekstern boks for å dekke det indre kammeret og holde kontrollenheten (<…

Discussion

Den endelige PhotoACT-enheten var praktisk å konstruere med kommersielt tilgjengelige, rimelige komponenter til en total kostnad på mindre enn $ 50. Ytterligere fordeler inkluderer lave vedlikeholdsbehov, kapasitet til å bestråle flere typer kulturplater, samtidig bruk av opptil fire enheter per analyse, lav vekt (2 kg) / størrelse (44 cm³) som tillater bærbarhet, nøyaktig og reproduserbar bestråling (data ikke vist), og et brukervennlig og enkelt oppsettgrensesnitt som ikke krever tilkobling til datam…

Materials

0.5% Trypsin-EDTA (10x)	Gibco	15400054	Mammalian cell culture dissociation reagent
3D printer	Flashforge		Finder model
96-well plates			Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture
Arduino
Brightness sensor			TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface
Buttons
Buzzer
Cell culture Flasks			Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes)
Centrifuge Tubes			Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay
CO2 Incubator
Controller board			ESP32
Design Software	Trimble		SketchUp
DMEM High Glucose	Gibco	11965092	DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells.
DMSO	Sigma-Aldrich	D4540-500ML	Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture
Fetal Bovine Serum	Gibco	12657029	FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages.
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15750060	Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination
Hemocytometer			Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay
Inverted Laboratory Microscope	Leica		DM IL LED
Laminar Flow Hood			Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures
LCD display
LED RGB WS2812			5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts
MDF fiberboards			3mm thickness medium-density fiberboards
Microcentrifuge Tubes			Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay
Microplate reader	ThermoFischer		Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation.
MTT Reagent	Invitrogen	M6494	3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays
Operational System	Real Time Engineers ltd.		FreeRTOS
P10 micripipette			Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity
P1000 micropipette			Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity
P200 micropipette			Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity
PDT Equipment	LumaCare		Model LC-122
Phosphate-Buffered Saline pH 7.4	Gibco	10010031	Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures
Potentiometers
Tips			Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes
Verteporfin	Sigma-Aldrich	SML0534-5MG	Verteporfin, ≥94% (HPLC)