Um dispositivo de terapia fotodinâmica interno construído internamente e baseado em diodo emissor de luz para melhorar a citotoxicidade da verteporfina em um modelo de cultura de células 2D

Resumo

Aqui, descrevemos um dispositivo novo, simples e de baixo custo para realizar com sucesso ensaios de terapia fotodinâmica in vitro (TFD) usando cultura de células HeLa bidimensionais e verteporfina como fotossensibilizador.

Resumo

Este artigo descreve um dispositivo novo, simples e de baixo custo para realizar ensaios de terapia fotodinâmica in vitro (TFD), chamado PhotoACT. O dispositivo foi construído usando um conjunto de diodos emissores de luz programáveis convencionais (LEDs), um módulo de display de cristal líquido (LCD) e um sensor de luz conectado a uma placa microcontroladora comercial. A estrutura baseada em caixa do protótipo foi feita com painéis de fibra de média densidade (MDFs). O compartimento interno pode alocar simultaneamente quatro microplacas multipoços de cultura celular.

Como prova de conceito, estudamos o efeito citotóxico do fotossensibilizador (PS) verteporfina contra a linhagem celular HeLa em cultura bidimensional (2D). As células HeLa foram tratadas com concentrações crescentes de verteporfina por 24 h. O meio sobrenadante contendo fármaco foi descartado, as células aderentes foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e o meio livre de drogas foi adicionado. Neste estudo, o efeito da verteporfina nas células foi examinado sem exposição à luz ou após exposição por 1 h à luz usando valores vermelho-verde-azul (RGB) de 255, 255 e 255 (fluência média de 49,1 ± 0,6 J/cm²). Após 24 h, a viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazólio (MTT).

Os resultados experimentais mostraram que a exposição das células tratadas com verteporfina à luz do dispositivo aumenta o efeito citotóxico da droga através de um mecanismo mediado por espécies reativas de oxigênio (ROS). Além disso, o uso do protótipo descrito neste trabalho foi validado comparando-se os resultados com um dispositivo PDT comercial. Assim, este protótipo de terapia fotodinâmica à base de LED representa uma boa alternativa para estudos in vitro de TFD.

Introdução

Entre as doenças não transmissíveis mais letais, o câncer representa uma das principais causas globais de morte prematura. Foi responsável por quase 10 milhões de mortes em 2020, representando cerca de uma em cada seis mortes em todo o mundo¹. Além disso, o fenômeno da multirresistência (MDR) representa uma tremenda ameaça à saúde pública, uma vez que os protocolos quimioterápicos aprovados não atingem os estágios de remissão para essa condição clínica². As células cancerosas podem desenvolver resistência à quimioterapia através de vários mecanismos; no entanto, a superexpressão de alguns transportadores de de ligação a ....

Protocolo

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e software usados neste protocolo.

1. Construção do dispositivo

1. Serra de 3 mm de espessura de painéis de fibra de média densidade (MDF) para obtenção de peças com as dimensões mostradas na Figura 1A.
   Observação : use o arquivo vetorial (arquivo suplementar 1) para o corte de controle numérico computadorizado (CNC).
2. Construa duas caixas com as seguintes dimensões (comprimento x largura x altura): 330 mm x 235 mm x 225 mm para as caixas mai....

Resultados

O dispositivo PDT final, chamado de PhotoACT, incluía uma câmara escura para alocar até quatro microplacas multipoço, com sua superfície interna superior equipada com um conjunto de 30 LEDs dispersos programados para emitir espectros distintos de luz visível (Figura 3 e Arquivo Suplementar 6). O dispositivo foi construído utilizando duas caixas associadas: uma caixa interna projetada como uma câmara escura para os ensaios de PDT e uma caixa externa para cobrir a câmara inter.......

Discussão

O dispositivo PhotoACT final foi conveniente para construir com componentes de baixo custo disponíveis comercialmente a um custo total de menos de US $ 50. As vantagens adicionais incluem baixas demandas de manutenção, a capacidade de irradiar vários tipos de placas de cultura, o uso simultâneo de até quatro unidades por ensaio, baixo peso (2 kg)/tamanho (44 cm³) que permite portabilidade, irradiação precisa e reprodutível (dados não mostrados) e uma interface de configuração simples e fácil de usar que não re.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,5% Tripsina-EDTA (10x)	Gibco	15400054	Reagente de dissociação de cultura de células de mamíferos
Impressora 3D	Flashforge		Finder modelo
Placas			Placas de superfície não estéreis, de poliestireno e de alta ligação com poços de fundo plano usados para cultura de células 2D
Arduino
Sensor		de brilho	Modelo TSL2561 com níveis de detecção de 0,1-40.000+ lux e interface I2C
Botões
Campainha
Frascos			Balão de fundo retangular, estéril, de poliestireno com superfície tratada com cultura de tecidos (TC), gargalo inclinado e tampa de ventilação (tamanhos)
Tubos de			centrífugaTubos estéreis de polipropileno com capacidade de 15/50 mL utilizados para diluição da cultura celular na etapa de semeadura do ensaio
CO2 Placa
	ESP32
			DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) é um meio basal amplamente utilizado para apoiar o crescimento de muitas células de mamíferos diferentes.
DMSO	Sigma-Aldrich	D4540-500ML	Dimetil sulfóxido, ≥ 99,5% (GC), adequado para cultura de células vegetais
Soro Fetal Bovino	A Gibco	12657029	a FBS oferecem o melhor valor, proporcionando consistência de crescimento celular ao longo do tempo e das passagens.
Gentamicina (50 mg/mL)	Gibco	15750060	Antibiótico solúvel em água originalmente purificado do fungo  Micromonospora purpurea. A gentamicina actua prevenindo a contaminação da cultura de células
Hemocitómetro			Câmara padronizada Neubauer utilizada para contagem de células na etapa de semeadura do ensaio
Microscópio de Laboratório Invertido	Leica		DM IL
LED Laminar Flow Hood			Cabin concebida para proteger o ambiente de trabalho de contaminantes, mantendo um fluxo constante e unidireccional de ar filtrado por HEPA sobre o trabalho área. Usado em várias etapas dos procedimentos de cultivo e tratamento de células
display
LED RGB WS2812			5050 RGB SMD modelo com processador integrado. Fita com 30 LEDs, 1 metro de comprimento e 9 watts
de painéis de fibra			Painéis de fibra de média densidade de 3mm de espessura
		microcentrífuga	Tubos estéreis, de polipropileno com tampa de segurança e capacidade de 1,5/2,0 mL. Ferramentas convenientes para manipular pequenos volumes na etapa de tratamento do ensaio
Leitor de microplacas	ThermoFischer		Multiskan FC projetado para detectar uma ampla faixa de comprimento de onda de absorbância (340-850 nm). O equipamento foi utilizado para avaliar a viabilidade celular após a incubação do MTT.
Brometo	Invitrogen	M6494	MTT. Usado para ensaios de viabilidade celular
Sistema	operacional Real Time Engineers ltd.
P10			Capacidade L
P1000 micropipeta			Não eletrônica, monocanal, 10-1000 μ Capacidade L
P200 micropipeta			Não eletrônica, monocanal, 20-200 μ Capacidade L
Equipamento PDT	LumaCare		Modelo LC-122
Solução salina tamponada com fosfato pH 7,4	Gibco	10010031	Formulação de sal balanceada usada para lavar células durante o cultivo e procedimentos de ensaio
Pontas
			L volumes máximos
Verteporfina	Sigma-Aldrich	SML0534-5MG	Verteporfina, ≥ 94% (HPLC)

de 96 poços de cultura de células controladora da incubadora Software de design Trimble SketchUp DMEM High Glucose Gibco 11965092 , LCD de MDF Tubos de Fotômetro de microplacas de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio do reagente Micripipeta FreeRTOS Não eletrônica, monocanal, 1-10 μ de potenciômetros Não estéril, ajuste universal, 10/200/1000 μ