Un dispositivo de terapia fotodinámica construido internamente y basado en diodos emisores de luz para mejorar la citotoxicidad de la verteporina en un modelo de cultivo celular 2D

Summary

Aquí, describimos un dispositivo novedoso, simple y de bajo costo para realizar con éxito ensayos de terapia fotodinámica in vitro (TFD) utilizando cultivo de células HeLa bidimensionales y verteporfina como fotosensibilizador.

Abstract

Este documento describe un dispositivo novedoso, simple y de bajo costo para realizar ensayos de terapia fotodinámica in vitro (TFD), llamado PhotoACT. El dispositivo se construyó utilizando un conjunto de diodos emisores de luz (LED) programables convencionales, un módulo de pantalla de cristal líquido (LCD) y un sensor de luz conectado a una placa de microcontrolador comercial. La estructura basada en caja del prototipo se hizo con tableros de fibra de densidad media (MDF). El compartimento interno puede asignar simultáneamente cuatro microplacas multipocillos de cultivo celular.

Como prueba de concepto, estudiamos el efecto citotóxico de la verteporfina fotosensibilizadora (PS) contra la línea celular HeLa en cultivo bidimensional (2D). Las células HeLa fueron tratadas con concentraciones crecientes de verteporfina durante 24 h. Se descartó el medio sobrenadante que contenía fármaco, las células adherentes se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se agregó un medio libre de fármaco. En este estudio, el efecto de la verteporfina en las células se examinó sin exposición a la luz o después de la exposición durante 1 h a la luz utilizando valores rojo-verde-azul (RGB) de 255, 255 y 255 (fluencia promedio de 49.1 ± 0.6 J / cm²). Después de 24 h, la viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazolio (MTT).

Los resultados experimentales mostraron que la exposición de las células tratadas con verteporfina a la luz del dispositivo mejora el efecto citotóxico del fármaco a través de un mecanismo mediado por especies reactivas de oxígeno (ROS). Además, el uso del prototipo descrito en este trabajo se validó comparando los resultados con un dispositivo PDT comercial. Por lo tanto, este prototipo de terapia fotodinámica basada en LED representa una buena alternativa para los estudios in vitro de TFD.

Introduction

Entre las enfermedades no transmisibles más letales, el cáncer representa una de las principales causas mundiales de muerte prematura. Representó casi 10 millones de muertes en 2020, lo que representa aproximadamente una de cada seis muertes en todo el mundo¹. Además, el fenómeno de la resistencia a múltiples fármacos (MDR) representa una tremenda amenaza para la salud pública, ya que los protocolos quimioterapéuticos aprobados no alcanzan las etapas de remisión para esta condición clínica². Las células cancerosas pueden desarrollar resistencia a la quimioterapia a través de varios mecanismos; sin embargo, la sobreexpresión de algunos transportadores de casetes de unión a ATP (ABC) – bombas de eflujo dependientes de ATP – se considera la principal causa del desarrollo de MDR dentro de un microambiente tumoral³. Además de la MDR, otras complicaciones del cáncer, como la recurrencia y la metástasis, refuerzan la demanda urgente de desarrollar y mejorar los enfoques terapéuticos para superar este desafío oncológico.

La utilización curativa de la luz se ha practicado durante siglos⁴, y la terapia fotodinámica (TFD) representa un enfoque terapéutico clínicamente aprobado para tumores sólidos. La TFD combina la administración de un fotosensibilizador (PS) seguido de irradiación lumínica para generar especies reactivas de oxígeno (ROS) para ejercer citotoxicidad selectiva en las células tumorales. Este enfoque terapéutico es superior a los métodos convencionales, incluyendo cirugía, radiación y quimioterapia⁵; Es una técnica mínimamente invasiva que muestra menor citotoxicidad en los tejidos conectivos⁶. La aplicación ligera y la acumulación de PS directamente en el tumor o su microambiente aseguran una focalización precisa y, en consecuencia, efectos secundarios sistémicos menores e indeseables⁷ y la posibilidad de repetir el tratamiento en el mismo sitio. Además, el costo es menor que el de otros enfoques. Debido a sus características prometedoras, la TFD puede ser considerada una opción apropiada tanto para el tratamiento del cáncer único, especialmente en el caso de tumores inoperables, como para el tratamiento adyuvante^{del cáncer 7}, y representa una alternativa para la MDR relacionada a la quimioterapia ^8,9.

El primer informe que muestra una alta tasa de respuesta objetiva utilizando PDT se describió en 1975 en un modelo de ratón y rata¹⁰. Desde entonces, se han realizado estudios con TFD con resultados positivos⁷ tanto in vivo como in vitro con líneas celulares tumorales humanas en cultivo celular 2D^11,12. Teniendo en cuenta la amplia aplicabilidad de la PS clínicamente aprobada, independientemente de sus vías de acumulación específicas y rangos de longitud de onda de los picos de absorción, el proceso general es el siguiente: (i) captación de PS, (ii) pico de concentración de PS en el tumor o su microambiente, (iii) aplicación de luz, (iv) interacción PS-luz, (v) transferencia de energía en estado excitado PS a cualquier sustrato tisular o moléculas de oxígeno circundantes, (vi) producción de ROS que involucra oxígeno singlete o anión superóxido, (vii) muerte de células tumorales a través de, esencialmente, necrosis o apoptosis (muerte directa), autofagia (mecanismo citoprotector), isquemia tisular (daño vascular), modulación inmune o una superposición de estos mecanismos⁷. En esta etapa final, la activación de una vía específica de muerte celular depende de muchos factores, como las características celulares, el diseño experimental y, lo más importante, la localización intracelular de PS y el daño dirigido relacionado con PDT¹³.

La verteporfina es un PS de segunda generación, aprobado por las agencias reguladoras para uso clínico en Noruega y China para tratar la degeneración macular relacionada con la edad⁷. Después de la administración de la dosis, se informó que este profármaco se acumuló parcialmente en las mitocondrias¹⁴ e indujo la fosforilación de la proteína tirosina celular y la fragmentación del ADN, lo que llevó a la apoptosis de las células tumorales^15,16. Después de 24 h de incubación para la internalización de verteporfina, se recomienda un protocolo PDT utilizando una configuración de longitud de onda de 690 nm para lograr niveles efectivos de transferencia de radiación electromagnética a moléculas adyacentes ^7,17.

En cuanto a la fuente de luz para PDT, los sistemas láser de diodo clásicos suelen ser caros, técnicamente complicados, de gran tamaño y, por lo tanto, inportátiles^18,19. Como consecuencia de su perfil de longitud de onda única, que también se puede observar en equipos PDT basados en LED, la demanda de unidades independientes para cada aplicación de fotosensibilizador hace que la utilización de sistemas láser de diodo sea aún más compleja y económicamente inviable^20,21. Por lo tanto, la utilización de maquinaria LED se considera la alternativa más prometedora para resolver no solo los costos²² y los problemas de mantenimiento, sino también para proporcionar una alta potencia de salida y menos dañina 23 y una capacidad de iluminación más amplia 24,25,26,27.

A pesar de la contribución potencial que los equipos basados en LED pueden ofrecer a los experimentos PDT²⁸, la mayoría de las opciones comerciales aún poseen inconvenientes como la falta de portabilidad, el alto costo y los complejos proyectos de construcción y operación²⁹. El objetivo principal de este trabajo fue ofrecer una herramienta simple y confiable para ensayos de TFD in vitro . Este documento describe PhotoACT, un dispositivo PDT basado en LED construido internamente, que es económico, fácil de usar y portátil. Como prueba de concepto, se ha demostrado que este dispositivo mejora la citotoxicidad de la verteporfina en un modelo de cultivo celular 2D y, por lo tanto, puede usarse como herramienta de investigación en experimentos PDT.

Protocol

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos y software utilizados en este protocolo. 1. Construcción del dispositivo Sierra de 3 mm de espesor de tableros de fibra de densidad media (MDF) para obtener piezas con las dimensiones mostradas en la Figura 1A.NOTA: Utilice el archivo vectorial (archivo complementario 1) para el corte de cont…

Representative Results

El dispositivo PDT final, llamado PhotoACT, incluía una cámara oscura para asignar hasta cuatro microplacas multipocil, con su superficie interior superior equipada con un conjunto de 30 LED dispersos programados para emitir distintos espectros de luz visible (Figura 3 y Archivo Suplementario 6). El dispositivo se construyó utilizando dos cajas asociadas: una caja interna diseñada como una cámara oscura para los ensayos PDT, y una caja externa para cubrir la cámara int…

Discussion

El dispositivo PhotoACT final fue conveniente de construir con componentes de bajo costo disponibles comercialmente a un costo total de menos de $ 50. Las ventajas adicionales incluyen bajas demandas de mantenimiento, la capacidad de irradiar múltiples tipos de placas de cultivo, el uso simultáneo de hasta cuatro unidades por ensayo, bajo peso (2 kg) / tamaño (44 cm³) que permite la portabilidad, irradiación precisa y reproducible (datos no mostrados) y una interfaz de configuración fácil de usar y simpl…

Materials

0.5% Trypsin-EDTA (10x)	Gibco	15400054	Mammalian cell culture dissociation reagent
3D printer	Flashforge		Finder model
96-well plates			Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture
Arduino
Brightness sensor			TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface
Buttons
Buzzer
Cell culture Flasks			Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes)
Centrifuge Tubes			Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay
CO2 Incubator
Controller board			ESP32
Design Software	Trimble		SketchUp
DMEM High Glucose	Gibco	11965092	DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells.
DMSO	Sigma-Aldrich	D4540-500ML	Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture
Fetal Bovine Serum	Gibco	12657029	FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages.
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15750060	Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination
Hemocytometer			Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay
Inverted Laboratory Microscope	Leica		DM IL LED
Laminar Flow Hood			Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures
LCD display
LED RGB WS2812			5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts
MDF fiberboards			3mm thickness medium-density fiberboards
Microcentrifuge Tubes			Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay
Microplate reader	ThermoFischer		Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation.
MTT Reagent	Invitrogen	M6494	3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays
Operational System	Real Time Engineers ltd.		FreeRTOS
P10 micripipette			Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity
P1000 micropipette			Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity
P200 micropipette			Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity
PDT Equipment	LumaCare		Model LC-122
Phosphate-Buffered Saline pH 7.4	Gibco	10010031	Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures
Potentiometers
Tips			Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes
Verteporfin	Sigma-Aldrich	SML0534-5MG	Verteporfin, ≥94% (HPLC)