यहां हम पुनः संयोजक ड्रोसोफिला कैसपेस ड्रोंक और ड्राइस को व्यक्त करने और शुद्ध करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, और इन विट्रो क्लीवेज परख में उनका उपयोग करते हैं।
कैसपेस बहुत विशिष्ट कोशिका मृत्यु प्रोटीज हैं जो एपोप्टोटिक और गैर-एपोप्टोटिक प्रक्रियाओं में शामिल हैं। जबकि एपोप्टोसिस के दौरान कैसपेस की भूमिका को बहुत अच्छी तरह से परिभाषित किया गया है और कैसपेस के कई एपोप्टोटिक प्रोटियोलिटिक सब्सट्रेट्स की पहचान और विशेषता की गई है, गैर-एपोप्टोटिक प्रक्रियाओं के लिए कैसपेस की भूमिका को अच्छी तरह से समझा नहीं गया है। विशेष रूप से, कैसपेस के कुछ गैर-एपोप्टोटिक सब्सट्रेट्स की पहचान अब तक की गई है। यहां, संभावित कैसपेस सब्सट्रेट्स की पहचान और लक्षण वर्णन की सुविधा के लिए, एक प्रोटोकॉल जो विट्रो में कैसपेज़ क्लीवेज परख में उम्मीदवार सब्सट्रेट्स के परीक्षण की अनुमति देता है, का वर्णन किया गया है। इस प्रोटोकॉल में पुनः संयोजक कैसपेज़ प्रोटीन का उत्पादन और शुद्धिकरण, उम्मीदवार सब्सट्रेट्स का उत्पादन या तो पुनः संयोजक रूप से या सेल-मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली में, और एसडीएस-पेज और इम्यूनोब्लोटिंग के बाद वास्तविक इन विट्रो क्लीवेज प्रतिक्रिया शामिल है। यह प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला कैसपेस ड्रोंक और ड्राइस के लिए तैयार किया गया है, लेकिन स्तनधारियों सहित अन्य जीवों से कैसपेस के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।
प्रोग्राम्ड सेल डेथ या एपोप्टोसिस को अत्यधिक विशिष्ट सेल डेथ प्रोटीज के एक वर्ग द्वारा निष्पादित किया जाता है जिसे कैसपेस कहा जाता है (संदर्भ1 में समीक्षा की गई)। कैसपेस सिस प्रोटीज हैं जिनमें उत्प्रेरक साइट में एक साइस अवशेष होता है। उन्होंने एएसपी अवशेषों के बाद आम सहमति दरार साइटों और क्लीवर सब्सट्रेट्स को प्रोटियोलिटिक रूप से परिभाषित किया है (हालांकि ड्रोसोफिला कैसपेस ड्रोंक को ग्लू अवशेषों2 के बाद छोड़ने की भी सूचना दी गई है)। उन्हें आरंभकर्ता (एपिकल या अपस्ट्रीम के रूप में भी जाना जाता है) और प्रभावकारक (निष्पादनकर्ता या डाउनस्ट्रीम) कैसपेस में विभाजित किया जाता है। आरंभकर्ता कैसपेस प्रभावकारक कैसपेस को सक्रिय करते हैं। उदाहरण के लिए, स्तनधारियों में, सर्जक कैसपेज़ -9 प्रभावक कैसपेज़ कैसपेज़ –3 3 को छोड़ देता है और सक्रिय करता है। इसी तरह, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में, कैसपेज़ -9-ऑर्थोलॉग ड्रोंक कैसपेज़ -3-ऑर्थोलॉग ड्राइस 2,4 को छोड़ देता है और सक्रिय करता है। एपोप्टोसिस के दौरान, प्रभावक कैसपेस सैकड़ों सब्सट्रेट्स को छोड़ देते हैं जिससे सेल 5 की मृत्यु होजाती है।
कैस्पेस को सेल में निष्क्रिय प्रोएंजाइम (ज़िमोजेन्स) के रूप में संश्लेषित किया जाता है। इस रूप में, उनमें एक एन-टर्मिनल प्रोडोमेन होता है, प्रोएंजाइम के मध्य भाग में उत्प्रेरक साइस के साथ एक बड़ा सबयूनिट, और सी-टर्मिनस1 (चित्रा 1) पर एक छोटा सबयूनिट होता है। सक्रियण का तंत्र आरंभकर्ता और प्रभावकारक कैसपेस के बीच भिन्न होता है। सर्जक कैसपेस (कैसपेज़ -9, ड्रोंक) को सक्रियण के लिए डिमराइजेशन की आवश्यकता होती है, जो एक बड़े प्रोटीन कॉम्प्लेक्स में शामिल होने से होता है, जिसे एपोप्टोसोम6 कहा जाता है। एपोप्टोसोम में शामिल होने के लिए, कैस्पेज़ -9 और ड्रोंक एन-टर्मिनल प्रोडोमेन (चित्रा 1) में एक कैसपेज़ सक्रियण और भर्ती डोमेन (CARD) लेते हैं। एपोप्टोसोम घटक Apaf-1 में एक CARD भी होता है और यह Cappase-9 या Dronc को CARD/CARD इंटरैक्शन के माध्यम से एपोप्टोसोम 3,6,7 में भर्ती करता है। जबकि कैस्पेज़ -9 और ड्रोंक को एपोप्टोसोम में प्रोटियोलिटिक रूप से संसाधित किया जा सकता है, यह प्रसंस्करण एंजाइमेटिक गतिविधि 8,9 के लिए पूरी तरह से आवश्यक नहीं है।
इसके विपरीत, प्रभावक कैसपेस (कैस्पेज़ -3, ड्राइस) अपने प्रोडोमेन में कार्ड नहीं लेते हैं और सक्रियण1 के लिए बड़े प्रोटीन परिसरों में शामिल नहीं होते हैं। वे क्रमशः सक्रिय कैस्पेज़ -9 या ड्रोंक1 द्वारा प्रोटियोलिटिक दरार पर निर्भर हैं। सक्रिय प्रभावक कैस्पेज़ दो बड़े और दो छोटे सबयूनिट्स से बना एक टेट्रामर बनाता है, और इस प्रकार इसमें दो उत्प्रेरक साइटें होती हैं (चित्रा 1)। महत्वपूर्ण रूप से इस प्रोटोकॉल के लिए, ई कोलाई में कैस्पेस की पुनः संयोजक अभिव्यक्ति कैसपेस के ऑटो-प्रोसेसिंग और सक्रियण का कारण बनती है, जिसमें ड्राइस10 और ड्रोंक 2,8,9,11,12 शामिल हैं, यहां तक कि एपफ -1 की अनुपस्थिति में भी। यह ऑटो-प्रोसेसिंग पुनः संयोजक कैसपेस प्रोटीन के साथ उम्मीदवार सब्सट्रेट्स के इन विट्रो क्लीवेज परख करने की अनुमति देता है।
कैसपेस न केवल एपोप्टोसिस में शामिल हैं, बल्कि उनके पास कई गैर-एपोप्टोटिक कार्य भी हो सकते हैं, जिनमें प्रसार, भेदभाव, सेल माइग्रेशन, न्यूरोनल छंटाई, जन्मजात प्रतिरक्षा और अन्य 13,14,15 शामिल हैं। वर्तमान में यह अज्ञात है कि गैर-एपोप्टोटिक प्रक्रियाओं के दौरान सक्रिय कैसपेस होने के बावजूद कोशिकाएं कैसे जीवित रह सकती हैं। यह संभव है कि ये कोशिकाएं केवल उप-घातक स्तर16 पर कैसपेस को सक्रिय करती हैं या वे कोशिका के गैर-एपोप्टोटिक डिब्बों जैसे प्लाज्मा झिल्ली17,18 में सक्रिय कैसपेस को अनुक्रमित करती हैं। इसलिए, गैर-एपोप्टोटिक सब्सट्रेट्स की पहचान और सत्यापन से न केवल यह पता चलेगा कि कैसपेस गैर-एपोप्टोटिक प्रक्रियाओं की मध्यस्थता कैसे करते हैं, बल्कि यह समझने में भी मदद कर सकते हैं कि सक्रिय कैसपेस की उपस्थिति में कोशिकाएं कैसे जीवित रह सकती हैं।
कैसपेस सब्सट्रेट के रूप में उम्मीदवार प्रोटीन को आनुवंशिक और जैव रासायनिक तरीकों का उपयोग करके पहचाना जा सकता है। आम सहमति से ड्रोंक दरार साइटों की उपस्थिति के लिए पहचाने गए प्रोटीन की जांच की जा सकती है। यह प्रोटीन अनुक्रम का नेत्रहीन निरीक्षण करके या कैसक्लेव (https://sunflower.kuicr.kyoto-u.ac.jp/~sjn/Cascleave/) 19,20 जैसे अधिक परिष्कृत ऑनलाइन जैव सूचना विज्ञान उपकरणों का उपयोग करके किया जा सकता है। ये उपकरण कैसपेस के नए लक्ष्यों की भविष्यवाणी करने के लिए कैसपेस और संरचनात्मक विचारों के ज्ञात आम सहमति दरार साइटों का उपयोग करते हैं। जबकि कैसक्लेव मानव कैसपेस -1, -3, -6, -7, और -8 से सत्यापित सब्सट्रेट्स की जानकारी को शामिल करता है, फिर भी यह यहां वर्णित उद्देश्यों के लिए भी उपयोगी हो सकता है क्योंकि ये कैसपेस और उनकी आम सहमति दरार साइटें अच्छी तरह से संरक्षित हैं। हालांकि, क्योंकि ड्रोंक क्लीवेज साइट को अच्छी तरह से परिभाषित नहीं किया गया है (दो अध्ययनों ने दो अलग-अलग इष्टतम दरार साइटों, टीएटीडी / ई2 और एलएएलडी9 की पहचान की है), उम्मीदवार सब्सट्रेट्स की जांच ड्राइस सहित अन्य कैसपेज़ क्लीवेज साइट की उपस्थिति के लिए भी की जाती है।
कैसपेस के अनुमानित सब्सट्रेट्स को मान्य करने के लिए, अतिरिक्त परख आवश्यक हैं। इनमें से एक परख यह प्रदर्शन है कि एक दिया गया कैसपेस वास्तव में विट्रो में उम्मीदवार प्रोटीन को छोड़ सकता है। यहां, हम इन विट्रो कैसपेज़ क्लीवेज परख के लिए एक सुविधाजनक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, उम्मीदवार सब्सट्रेट्स को कैस्पेज़ के रूप में ड्रोंक के साथ परीक्षण किया जाता है। उन्हें ड्राइस के सब्सट्रेट के रूप में भी परीक्षण किया जा सकता है। यद्यपि यह प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला कैसपेस ड्रोंक और ड्राइस के लिए लिखा गया है, इसे अन्य जीवों से कैसपेस के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है।
इन कैसपेस द्वारा उत्प्रेरक गतिविधि के नुकसान के कारण इन विट्रो क्लीवेज परख के साथ ड्रोंक और ड्राइस का निष्कर्षण और शुद्धिकरण उसी दिन किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल को पिछलेप्रकाशनों 8,9,11,12,21,22 से संशोधित और अनुकूलित किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, चार अलग-अलग कैसपेज़ प्रोटीन को ई कोलाई स्ट्रेन बीएल 21 (डीई 3) पीएलआईएसएस में पुनः संयोजक रूप से व्यक्त किया जाता है। ये प्रोटीन हैं: 6xHis-Droncwt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt, और 6xHis-DriceC211A। इन प्रोटीनों में से प्रत्येक को शुद्धिकरण के लिए एन-टर्मिनस पर 6 हिस्टिडाइन अवशेषों (6xHis) के साथ टैग किया गया है। ड्रोंकडब्ल्यूटी और ड्राइसडब्ल्यूटी जंगली प्रकार के प्रोटीन हैं और पुनः संयोजक अभिव्यक्ति पर सक्रिय कैसपेज़ में ऑटो-प्रोसेस कर सकते हैं। ड्रोंकसी 318 ए और ड्राइससी 211 ए ड्रोंक और ड्राइस के उत्परिवर्ती रूपों को एन्कोड करते हैं जो उत्प्रेरक साइस अवशेषों को अला अवशेषों में बदलते हैं। ये निर्माण उत्प्रेरक रूप से निष्क्रिय हैं और ऑटो-प्रोसेस नहीं कर सकते हैं (चित्रा 2 ए देखें)। उनका उपयोग क्लीवेज परख में नियंत्रण के रूप में किया जाता है। क्योंकि ड्राइससी 211 ए ऑटो-प्रोसेस नहीं कर सकता है, इसका उपयोग यहां वर्णित इन विट्रो क्लीवेज परख में ड्रोंकडब्ल्यूटी के लिए मॉडल सब्सट्रेट के रूप में भी किया जाता है।
कैस्पेस और कैसपेज़ फ़ंक्शन के बारे में हमारे ज्ञान का बड़ा हिस्सा पिछले तीन दशकों के दौरान एपोप्टोसिस में गहन काम से प्राप्त हुआ है। यह बहुत अच्छी तरह से स्थापित है कि सर्जक कैसपेस प्रोटियोलिटिक रूप से प्रभावक कैसपेस को संसाधित करते हैं, और एपोप्टोसिस 5,29 के दौरान सैकड़ों प्रोटीनों को प्रभावक कैस्पेस सब्सट्रेट के रूप में पहचाना गया है। इसके विपरीत, गैर-एपोप्टोटिक प्रक्रियाओं के लिए कैसपेस के कार्य के बारे में बहुत कम जाना जाता है और वे कौन से गैर-एपोप्टोटिक सब्सट्रेट्स संसाधित कर रहे हैं। यह कल्पनीय है कि आरंभकर्ता कैस्पेस यहां प्रमुख निर्णय निर्माता हैं। एपोप्टोसिस के दौरान, वे कोशिका मृत्यु के कारण प्रभावकारक कैसपेस को सक्रिय करते हैं। हालांकि, गैर-एपोप्टोटिक प्रक्रियाओं को ट्रिगर करने के लिए, वे विभिन्न प्रोटीनों (प्रभावकारक कैसपेस के अलावा) को सक्रिय कर सकते हैं, जो गैर-एपोप्टोटिक प्रक्रिया को नियंत्रित करते हैं। यह प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला 17,30 में सर्जक कैसपेज़ ड्रोंक के सब्सट्रेट के रूप में उम्मीदवार प्रोटीन का परीक्षण करता है।
दरार परख में परीक्षण किए जाने वाले सब्सट्रेट्स का उत्पादन या तो इन विट्रो स्तनधारी सेल-मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली जैसे आरआरएल या ई कोलाई में पुनः संयोजक अभिव्यक्ति द्वारा किया जा सकता है। बैक्टीरियल अभिव्यक्ति पर आरआरएल का उपयोग करके इन विट्रो अभिव्यक्ति के लिए कई फायदे हैं। आरआरएल अभिव्यक्ति प्रोटोकॉल सरल और तेज़ है, जिससे समानांतर में कई अलग-अलग सब्सट्रेट तैयार किए जा सकते हैं। कई मामलों में, रुचि के प्रोटीन वाले आरआरएल अर्क को क्लीवेज परख में उपयोग से पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है (हालांकि इसे प्रत्येक सब्सट्रेट के लिए अलग से निर्धारित करने की आवश्यकता होती है)। कथित सब्सट्रेट को एस35-मेट के साथ लेबल किया जा सकता है, जो एसडीएस-पेज के बाद ऑटोरेडियोग्राफी द्वारा आसान विश्लेषण की अनुमति देता है। यह विशेष रूप से उपयोगी है, अगर कोई सब्सट्रेट-विशिष्ट एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं है। वैकल्पिक रूप से, यदि एस35-मेट लेबलिंग वांछित नहीं है, तो कथित सब्सट्रेट को फ्लैग, एचए या माइक टैग जैसे सामान्य टैग के साथ टैग किया जा सकता है, जो इम्यूनोब्लोटिंग द्वारा कैसपेज़ दरार का पता लगाने की अनुमति देता है।
इस बात पर दृढ़ता से जोर देने की आवश्यकता है कि इस प्रोटोकॉल की सफलता पुनः संयोजक ड्रोंक और ड्राइस प्रोटीन के सावधानीपूर्वक और सुसंगत शुद्धिकरण पर निर्भर करती है। दुर्भाग्य से, इन प्रोटीनों को संग्रहीत नहीं किया जा सकता है – यहां तक कि अल्पकालिक भी नहीं – न तो फ्रिज में और न ही जमे हुए। वे किसी भी संग्रहीत रूप में रात भर एंजाइमेटिक गतिविधि खो देते हैं। इसलिए, उन्हें क्लीवेज परख के दिन ताजा तैयार करने की आवश्यकता है। परीक्षण किए जा रहे उम्मीदवार प्रोटीन (ओं) के बावजूद, ड्राइससी 211 ए को हमेशा ड्रोंकडब्ल्यूटी तैयारी की एंजाइमेटिक गतिविधि को मान्य करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाना चाहिए (चित्रा 2 बी, सी देखें)। वैकल्पिक रूप से, ड्रोंक और ड्राइस तैयारी की गतिविधि का परीक्षण फ्लोरोजेनिक सिंथेटिक टेट्रापेप्टाइड सब्सट्रेट्स 2,9,31 के इन विट्रो क्लीवेज द्वारा भी किया जा सकता है।
यदि एंटीबॉडी का उपयोग उम्मीदवार सब्सट्रेट्स का पता लगाने के लिए किया जाता है, तो उन्हें उपयोगकर्ता32,33 द्वारा मान्य करने की आवश्यकता होती है। यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी पर भी लागू होता है जो फ्लैग, एचए, माइक या अन्य जैसे एपिटोप टैग का पता लगाते हैं। खराब एंटीबॉडी गुणवत्ता महत्वपूर्ण परिणामों को अस्पष्ट कर सकती है। अलग-अलग टैग के साथ एन- और सी-टर्मिनस दोनों पर उम्मीदवार सब्सट्रेट्स की डबल-एपिटोप-टैगिंगकी भी सिफारिश की जाती है। यदि दरार होती है, तो डबल टैगिंग दोनों क्लीवेज उत्पादों का पता लगाने में मदद करती है और यह स्पष्ट करने में मदद कर सकती है कि दरार एक या अधिक साइटों पर होती है या नहीं।
जबकि यह प्रोटोकॉल आसानी से ड्रोंक, ड्राइस के ज्ञात जैविक सब्सट्रेट को मान्य करता है, सीमाएं भी हैं। एक सीमा यह है कि यह पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ एक इन विट्रो प्रोटोकॉल है। इन परखों में, कैसपेस एक गैर-शारीरिक रूप से उच्च सांद्रता पर मौजूद होते हैं, जो इस अवलोकन से स्पष्ट है कि वे ई कोलाई में अनायास ऑटो-प्रोसेस कर सकते हैं। सहज ऑटो-प्रोसेसिंग आमतौर पर शारीरिक स्थितियों के तहत नहीं होती है। यह उच्च कैसपेस एकाग्रता नकली गतिविधि का कारण बन सकती है जिसके परिणामस्वरूप गलत सकारात्मक हो सकते हैं। इन विट्रो क्लीवेज प्रतिक्रिया में कैसपेज़ एकाग्रता को कम करके झूठी सकारात्मकता को समाप्त किया जा सकता है। इसके अलावा, जैसा कि नीचे अधिक विस्तार से उल्लिखित है, वास्तविक सब्सट्रेट्स की पुष्टि करने और झूठे सकारात्मक को खत्म करने के लिए अतिरिक्त परख आवश्यक हैं।
पुनः संयोजक कैसपेस में वैसी विशिष्टता नहीं हो सकती है जितनी विवो में उनके सामान्य सेलुलर वातावरण में होती है। उदाहरण के लिए, कैस्पेस की गतिविधि को पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों द्वारा संशोधित किया जा सकता है। ये पुनः संयोजक प्रोटीन पर मौजूद नहीं हैं। इसके अलावा, विवो में, ड्रोंक सहित सर्जक कैसपेस को एपोप्टोसोम जैसे बड़े प्रोटीन परिसरों में शामिल किया जाता है। इस प्रोटोकॉल की शर्तों के तहत, एपोप्टोसोम का गठन हासिल नहीं किया जाता है। इसके लिए ड्रोसोफिला अपाफ -1 (उर्फ डार्क या एचएसी -1) 35-37 की पुनः संयोजक अभिव्यक्ति की आवश्यकता होगी, जिसकी अपनी चुनौतियां हैं। इसलिए, इन विट्रो में, ड्रोंक में वही विशिष्टता नहीं हो सकती है जो विवो में है।
यह भी कल्पनीय है कि ड्रोंक को गैर-एपोप्टोटिक प्रक्रियाओं के लिए एक अलग प्रोटीन कॉम्प्लेक्स में शामिल किया गया है। यह ड्रोंक को एक अलग दरार विशिष्टता प्रदान कर सकता है, जो यह भी समझा सकता है कि ड्रोंक गैर-एपोप्टोटिक स्थितियों के तहत एपोप्टोसिस को प्रेरित क्यों नहीं करता है। इससे संबंधित, CasCleave नए कैसपेज़ सब्सट्रेट्स की भविष्यवाणी करने के लिए ज्ञात दरार आम सहमति साइटों का उपयोग करता है। हालांकि, यह अज्ञात है कि क्या गैर-एपोप्टोटिक प्रक्रियाओं के लिए एक ही दरार आम सहमति साइटों का भी उपयोग किया जाता है। वास्तव में, हाल ही में, यह दिखाया गया था कि कैस्पेज़ -3 चूजा भ्रूण38 में विकासशील श्रवण ब्रेनस्टेम में एक गैर-एपोप्टोटिक प्रक्रिया के दौरान अपनी पसंदीदा आम सहमति साइट को बदलता है। इसी तरह, यदि सर्जक कैसपेस को विभिन्न प्रोटीन परिसरों में शामिल किया जाता है, तो उनकी एक अलग विशिष्टता हो सकती है और इस प्रकार विभिन्न आम सहमति अनुक्रमों पर छोड़ सकते हैं।
ये सीमाएं बताती हैं कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित इन विट्रो क्लीवेज परख पर पूरी तरह से भरोसा करना पर्याप्त नहीं है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त परिणामों को और मान्य करने के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण नियोजित किए जाने चाहिए। आदर्श रूप से, विवो परख में निम्नलिखित प्रश्नों को संबोधित करने के लिए उपयोग किया जाना चाहिए: क्या विवो में गैर-एपोप्टोटिक प्रक्रिया के दौरान उम्मीदवार प्रोटीन प्रोटियोलिटिक रूप से संसाधित होता है? यदि हां, तो क्या विवो और इन विट्रो में एक ही क्लीवेज साइट का उपयोग किया जाता है? यदि दरार साइट के म्यूटेनेसिस द्वारा दरार अवरुद्ध हो जाती है तो परिणाम क्या होगा? क्या उम्मीदवार सब्सट्रेट का प्रसंस्करण कैसपेस पर निर्भर है, और यदि हां, तो कौन सा? गैर-एपोप्टोटिक प्रक्रिया के लिए दरार के टुकड़ों की भूमिका क्या है? इन सवालों को मानक आनुवंशिक और ट्रांसजेनिक तरीकों का उपयोग करके सी एलिगेंस और ड्रोसोफिला जैसे आनुवंशिक मॉडल जीवों में आसानी से संबोधित किया जा सकता है।
सारांश में, यह प्रोटोकॉल एंजाइमेटिक रूप से सक्रिय कैसपेस का उत्पादन करने के लिए एक विश्वसनीय और सुसंगत विधि का वर्णन करता है, विशेष रूप से ड्रोसोफिला कैसपेस ड्रोंक और ड्राइस। इस प्रोटोकॉल का अंतिम लक्ष्य यह जांचना है कि क्या ड्रोंक विट्रो में उम्मीदवार सब्सट्रेट्स को छोड़ सकता है, जिन्हें आनुवंशिक, जैव रासायनिक या जैव सूचना विज्ञान दृष्टिकोण द्वारा पहचाना गया था। जैसा कि पिछले पैराग्राफ में बताया गया है, विवो में कैसपेज़ सब्सट्रेट के रूप में इन प्रोटीनों को मान्य करने के लिए अतिरिक्त परख की आवश्यकता होती है। मेटाज़ोआ में कैसपेज़ जीन के संरक्षण की डिग्री को देखते हुए, इस प्रोटोकॉल को अन्य जीवों से कैसपेस के लिए भी अनुकूलित करना संभव होना चाहिए।
The authors have nothing to disclose.
हम प्रयोगशाला में प्रोटोकॉल स्थापित करने में मदद के लिए डॉ एलिफ कंबर-काया को धन्यवाद देना चाहते हैं। गाइ साल्वेसेन ने कृपया ड्राइससी 211 ए उत्परिवर्ती9 प्रदान किया। इस काम को अनुदान संख्या 2R35GM118330 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) के राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान (NIGMS) से MIRA पुरस्कार द्वारा वित्त पोषित किया गया था। अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी।
Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | |
Anti-His antibody | Sigma-Aldrich | MA1-21315 | |
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell signaling | 7076P2 | |
Anti-Myc antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell signaling | 7074P2 | |
Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
BioPhotometer | Eppendorf | #6131 | |
BL21 (DE3) pLysS Competent Cells | Promega | L1195 | |
Centrifuge rotor | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023-1G | |
ChemiDoc with image software | Bio-Rad | Universal Hood II | For Chemiluminiscence imaging |
Chemiluminiscence Substrate | Thermofisher Scientific | 34095 | For Chemiluminiscence imaging |
Cleaved Drosophila ICE (drICE) (Asp230) Antibody | Cell Signaling Technology | 9478S | |
Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955128 | Used to measure bacterial growth and protein concentration |
Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610610 | |
Erlenmeyer flasks, 1000 mL | Millipore sigma | CLS49801L | For LB agar media preparation and autoclaving |
Erlenmeyer flasks, 250 mL | Millipore sigma | CLS4980250 | For bacterial culture growth and induction. |
Ethylene-diamine-tetra-acetic Acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
Gel tank SDS-PAGE system | Thermofisher Scientific | STM1001 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermofisher scientific | 87786 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
His-Drice-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
His-DriceC211A-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
His-Dronc-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
His-DroncC318A-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | |
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermofisher Scientific | FERR0392 | |
Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | |
LB Agar, Miller (Powder) | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
Lysozyme | Thermofisher Scientific | 90082 | |
Microbiological plate incubator | Fisher Scientific | 11-690-650D | For colony growth after transformation |
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 22363611 | |
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | |
Midiprep kit | Qiagen | 12243 | |
Mini tube rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 | for mixing bacterial lysates and Ni-NTA agarose |
Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
Motorized Pipette Controller | Gilson | F110120 | For using serological pipettes |
NaH2PO4 | Fisher Scientific | BP330-1 | |
Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Midi Protein Gel, 20-well | Thermofisher Scientific | WG1402BOX | |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermofisher Scientific | NP0007 | |
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20x) | Thermofisher Scientific | NP0001 | |
NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Invitrogen | NP00061 | |
Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | C25 incubator shaker | |
Petridish 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Plating beads | Zymo research | S1001 | For spreading culture on AmpR/KanR plates |
Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | 34924 | For purification of His-tagged proteins |
Precision Plus Protein Standards | Bio-Rad | #161-0374 | |
Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | #5000006 | |
pT7CFE1-NMyc | Thermofisher Scientific | 88863 | For cloning substrates for RRL expression |
PVDF membrane | Invitrogen | LC2007 | |
14 mL Polypropylene round bottom tubes | Fisher Scientific | 352029 | For growing plasmid cultures |
QiaRack | Qiagen | 19095 | For holding polypropylene columns during purification |
Refrigerated High speed Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | |
rRNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N251A | For RRL expression |
Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
Sterile Falcon tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
Sterile Falcon tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S70903-250G | |
1 mL Serological Pipets, Sterile | celltreat | 229001B | For bacterial cell lysis in 50 mL tubes |
TnT Coupled Reticulocyte Lysate -T7 | Promega | L4611 | |
Tris-base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Waterbath | Fisher Scientific | 2340 | |
Western wet transferring cassette | Thermofisher Scientific | STM2001 |