Här presenterar vi ett protokoll för att uttrycka och rena rekombinanta Drosophila caspases Dronc och Drice, och deras användning i in vitro klyvningsanalyser.
Kaspaser är mycket specifika celldödsproteaser som är involverade i apoptotiska och icke-apoptotiska processer. Medan caspases roll under apoptos har varit mycket väldefinierad och många apoptotiska proteolytiska substrat av caspaser har identifierats och karakteriserats, är caspasernas roll för icke-apoptotiska processer inte väl förstådd. I synnerhet har få icke-apoptotiska substrat av caspaser hittills identifierats. Här, för att underlätta identifiering och karakterisering av potentiella kaspassubstrat, beskrivs ett protokoll som möjliggör testning av kandidatsubstrat i caspasklyvningsanalyser in vitro . Detta protokoll inkluderar produktion och rening av rekombinanta caspasproteiner, produktion av kandidatsubstraten antingen rekombinant eller i ett cellfritt uttryckssystem och den faktiska klyvningsreaktionen in vitro följt av SDS-PAGE och immunoblotting. Detta protokoll är skräddarsytt för Drosophila caspases Dronc och Drice men kan enkelt anpassas för caspaser från andra organismer, inklusive däggdjur.
Programmerad celldöd eller apoptos utförs av en klass av högspecialiserade celldödsproteaser som kallas caspaser (granskad i referens1). Caspaser är Cys-proteaser som innehåller en Cys-rest i det katalytiska stället. De har definierat konsensusklyvningsställen och klyver substrat proteolytiskt efter Asp-rester (även om Drosophila caspase Dronc också har rapporterats klyva efter Glu-rester2). De är indelade i initiator (även känd som apikal eller uppströms) och effektor (bödel eller nedströms) caspaser. Initiatorkaspaser aktiverar effektorkaspaser. Till exempel, hos däggdjur, klyver initiativtagaren caspase Caspase-9 och aktiverar effektorn caspase Caspase-33. På samma sätt, i Drosophila melanogaster, klyver caspase-9-ortholog Dronc och aktiverar caspase-3-ortholog Drice 2,4. Under apoptos klyver effektorkaspaser hundratals substrat som leder till cellens död5.
Kaspaser syntetiseras som inaktiva proenzymer (zymogener) i cellen. I denna form innehåller de en N-terminal prodomän, en stor underenhet med katalytisk Cys i den centrala delen av proenzymet och en liten underenhet vid C-terminalen 1 (Figur 1). Aktiveringsmekanismen skiljer sig mellan initiator- och effektorkaspaser. Initiatorkaspaser (Caspase-9, Dronc) kräver dimerisering för aktivering, vilket sker genom införlivande i ett stort proteinkomplex, kallat apoptosom6. För införlivandet i apoptosomen har Caspase-9 och Dronc en caspaseaktiverings- och rekryteringsdomän (CARD) i N-terminalprodomänen (figur 1). Apoptosomkomponenten Apaf-1 innehåller också ett CARD och rekryterar Caspase-9 eller Dronc via CARD/CARD-interaktion till apoptosomen 3,6,7. Medan Caspase-9 och Dronc kan bearbetas proteolytiskt i apoptosomen, är denna bearbetning inte helt nödvändig för enzymatisk aktivitet 8,9.
Däremot bär effektorkaspaser (Caspase-3, Drice) inte ett kort i sina prodomainer och införlivas inte i stora proteinkomplex för aktivering1. De är beroende av proteolytisk klyvning av aktiv Caspase-9 respektive Dronc1. Den aktiva effektorkaspasen bildar en tetramer bestående av två stora och två små underenheter och innehåller således två katalytiska platser (figur 1). Viktigt för detta protokoll är att rekombinant uttryck av caspaser i E. coli orsakar automatisk bearbetning och aktivering av caspaser, inklusive Drice 10 och Dronc 2,8,9,11,12, även i frånvaro av Apaf-1. Denna automatiska bearbetning gör det möjligt att utföra in vitro-klyvningsanalyser av kandidatsubstrat med rekombinant kaspasprotein.
Kaspaser är inte bara involverade i apoptos, men de kan också ha många icke-apoptotiska funktioner, inklusive proliferation, differentiering, cellmigration, neuronal beskärning, medfödd immunitet och andra13,14,15. Det är för närvarande okänt hur celler kan överleva trots att de innehåller aktiva kaspaser under icke-apoptotiska processer. Det är möjligt att dessa celler endast aktiverar kaspaser vid subletala nivåer16 eller att de binder aktiva caspaser i icke-apoptotiska fack i cellen, såsom plasmamembranet17,18. Därför kommer identifiering och verifiering av icke-apoptotiska substrat inte bara att avslöja hur kaspaser förmedlar icke-apoptotiska processer utan kan också hjälpa till att förstå hur celler kan överleva i närvaro av aktiva caspaser.
Kandidatproteiner som caspassubstrat kan identifieras med hjälp av genetiska och biokemiska metoder. Identifierade proteiner kan kontrolleras för närvaron av konsensus Dronc klyvningsställen. Detta kan göras genom att visuellt inspektera proteinsekvensen eller använda mer sofistikerade bioinformatiska verktyg online som CasCleave (https://sunflower.kuicr.kyoto-u.ac.jp/~sjn/Cascleave/)19,20. Dessa verktyg använder de kända konsensusklyvningsställena för kaspaser och strukturella överväganden för att förutsäga nya mål för caspaser. Medan CasCleave innehåller information om verifierade substrat från humana Caspases-1, -3, -6, -7 och -8, kan det ändå också vara användbart för de ändamål som beskrivs här eftersom dessa caspaser och deras konsensusklyvningsställen är välbevarade. Men eftersom Dronc-klyvningsstället inte är väldefinierat (två studier identifierade två olika optimala klyvningsställen, TATD/E2 och LALD9), undersöks kandidatsubstraten också för förekomst av andra kaspasklyvningsställen, inklusive Drice.
För att validera de förutsagda substraten av caspaser krävs ytterligare analyser. En av dessa analyser är demonstrationen att en given kaspas faktiskt kan klyva kandidatproteinet in vitro. Här tillhandahåller vi ett bekvämt protokoll för in vitro-kaspasklyvningsanalyser. Med hjälp av detta protokoll testas kandidatsubstrat med Dronc som caspase. De kan också testas som substrat av Drice. Även om detta protokoll är skrivet för Drosophila caspases Dronc och Drice, kan det också anpassas för caspaser från andra organismer.
Extraktionen och reningen av Dronc och Drice tillsammans med in vitro-klyvningsanalysen måste utföras samma dag på grund av förlusten av katalytisk aktivitet av dessa caspaser. Detta protokoll har modifierats och optimerats från tidigare publikationer 8,9,11,12,21,22. I detta protokoll uttrycks fyra olika kaspasproteiner rekombinant i E. coli-stammen BL21 (DE3) pLysS. Dessa proteiner är: 6xHis-Droncwt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt och 6xHis-DriceC211A. Var och en av dessa proteiner är märkt med 6 histidinrester (6xHis) vid N-terminalen för rening. Dronc wt och Dricewt är proteiner av vild typ och kan automatiskt bearbetas till den aktiva caspasen vid rekombinant uttryck. DroncC318A och DriceC211A kodar för mutanta former av Dronc och Drice som förändrar den katalytiska Cys-återstoden till en Ala-rest. Dessa konstruktioner är katalytiskt inaktiva och kan inte bearbetas automatiskt (se figur 2A). De används som kontroller i klyvningsanalysen. Eftersom DriceC211A inte kan bearbeta automatiskt används den också som modellsubstrat för Droncwt i den in vitro-klyvningsanalys som beskrivs här.
Huvuddelen av vår kunskap om kaspaser och kaspasfunktion har härletts från intensivt arbete inom apoptos under de senaste tre decennierna. Det är mycket väl etablerat att initiatorkaspaser proteolytiskt bearbetar effektorkaspaser, och hundratals proteiner har identifierats som effektorkaspassubstrat under apoptos 5,29. Däremot är mycket mindre känt om funktionen av caspaser för icke-apoptotiska processer och vilka icke-apoptotiska substrat de bearbetar. Det är tänkbart att initiativtagare är viktiga beslutsfattare här. Under apoptos aktiverar de effektorkaspaser som orsakar celldöd. För att utlösa icke-apoptotiska processer kan de emellertid aktivera olika proteiner (andra än effektorkaspaser), som styr den icke-apoptotiska processen. Detta protokoll testar kandidatproteiner som substrat av initiatorkaspaset Dronc i Drosophila 17,30.
De substrat som ska testas i klyvningsanalysen kan produceras antingen i ett in vitro-system för cellfritt uttryck hos däggdjur, såsom RRL, eller genom rekombinant uttryck i E. coli. Det finns flera fördelar med in vitro-uttryck med RRL jämfört med bakteriellt uttryck. RRL-uttrycksprotokollet är enkelt och snabbt, vilket gör att många olika substrat kan beredas parallellt. I många fall kan RRL-extraktet som innehåller proteinet av intresse lagras vid -80 °C före användning i klyvningsanalysen (även om detta måste bestämmas separat för varje substrat). Det förmodade substratet kan märkas med S35-Met, vilket möjliggör enkel analys genom autoradiografi efter SDS-PAGE. Det är särskilt användbart om ingen substratspecifik antikropp finns tillgänglig. Alternativt, om S35-Met-märkning inte önskas, kan det förmodade substratet märkas med vanliga taggar som flagg-, ha- eller Myc-taggar, vilket möjliggör detektering av caspas-klyvning genom immunoblotting.
Det måste starkt betonas att framgången för detta protokoll beror på noggrann och konsekvent rening av de rekombinanta Dronic- och Drice-proteinerna. Tyvärr kan dessa proteiner inte förvaras – inte ens på kort sikt – varken i kylen eller frysas. De förlorar den enzymatiska aktiviteten över natten i någon lagrad form. Därför måste de förberedas nyligen på dagen för klyvningsanalysen. Oavsett vilket eller vilka kandidatproteiner som testas bör DriceC211A alltid användas som en positiv kontroll för att validera den enzymatiska aktiviteten hos Droncwt-preparatet (se figur 2B,C). Alternativt kan aktiviteten hos Dronic- och Drice-preparaten också testas genom in vitro-klyvning av fluorogena syntetiska tetrapeptidsubstrat 2,9,31.
Om antikroppar används för att detektera kandidatsubstraten måste de valideras av användaren32,33. Det gäller även kommersiellt tillgängliga antikroppar som upptäcker epitoptaggar som Flag, HA, Myc eller andra. Dålig antikroppskvalitet kan skymma viktiga resultat. Dubbel-epitop-taggning av kandidatsubstraten på både N- och C-änden med olika taggar rekommenderas också34. Om klyvning sker hjälper dubbelmärkning till att spåra båda klyvningsprodukterna och kan hjälpa till att belysa om klyvning sker på en eller flera platser.
Även om detta protokoll enkelt validerar det kända biologiska substratet för Dronc, Drice, finns det också begränsningar. En begränsning är att detta är ett in vitro-protokoll med rekombinanta proteiner. I dessa analyser är caspaserna närvarande i en ofysiologiskt hög koncentration, vilket framgår av observationen att de spontant kan auto-bearbeta i E. coli. Den spontana autobehandlingen sker vanligtvis inte under de fysiologiska förhållandena. Denna höga kaspaskoncentration kan orsaka falsk aktivitet som resulterar i falska positiva resultat. Falska positiva resultat kan elimineras genom att sänka kaspaskoncentrationen i in vitro-klyvningsreaktionen. Dessutom, som beskrivs mer detaljerat nedan, är ytterligare analyser nödvändiga för att bekräfta äkta substrat och för att eliminera falska positiva resultat.
De rekombinanta kaspaserna kanske inte har samma specificitet som de har i sin normala cellulära miljö in vivo. Till exempel kan aktiviteten hos caspaser modifieras genom post-translationella modifieringar. Dessa finns inte på de rekombinanta proteinerna. Vidare införlivas initiatorkaspaser in vivo, inklusive Dronc, i stora proteinkomplex såsom apoptosomen. Under villkoren i detta protokoll uppnås inte bildandet av apoptosomen. Det skulle kräva rekombinant uttryck av Drosophila Apaf-1 (aka Dark eller Hac-1)35-37 som har egna utmaningar. Därför kan Dronc in vitro inte ha samma specificitet som den har in vivo.
Det är också tänkbart att Dronc införlivas i ett annat proteinkomplex för icke-apoptotiska processer. Detta kan ge en annan klyvningsspecificitet än Dronc, vilket också kan förklara varför Dronc inte inducerar apoptos under icke-apoptotiska förhållanden. I samband med detta använder CasCleave de kända klyvningskonsensusplatserna för att förutsäga nya kaspassubstrat. Det är emellertid okänt om samma klyvningskonsensusplatser också används för icke-apoptotiska processer. Faktum är att det nyligen visades att Caspase-3 ändrar sin föredragna konsensusplats under en icke-apoptotisk process i den utvecklande auditiva hjärnstammen i kycklingembryot38. På samma sätt, om initiatorkaspaser införlivas i olika proteinkomplex, kan de ha en annan specificitet och kan därmed klyva vid olika konsensussekvenser.
Dessa begränsningar visar att det inte är tillräckligt att enbart förlita sig på de in vitro-klyvningsanalyser som beskrivs i detta protokoll. Alternativa metoder bör användas för att ytterligare validera de resultat som erhållits med hjälp av detta protokoll. Helst bör in vivo-analyser användas för att ta itu med följande frågor: Behandlas kandidatproteinet proteolytiskt under den icke-apoptotiska processen in vivo? Om så är fallet, används samma klyvningsställe in vivo och in vitro? Vad är konsekvensen om klyvningen blockeras av mutagenes på klyvningsstället? Är bearbetningen av kandidatsubstratet beroende av caspaser, och i så fall vilken? Vilken roll har klyvningsfragmenten för den icke-apoptotiska processen? Dessa frågor kan enkelt hanteras i de genetiska modellorganismerna som C. elegans och Drosophila med hjälp av vanliga genetiska och transgena metoder.
Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll en tillförlitlig och konsekvent metod för att producera enzymatiskt aktiva caspaser, särskilt Drosophila caspases Dronc och Drice. Det slutliga målet med detta protokoll är att undersöka om Dronc kan klyva kandidatsubstrat in vitro, som identifierades med genetiska, biokemiska eller bioinformatiska metoder. Som förklarats i föregående stycke krävs ytterligare analyser för att validera dessa proteiner som kaspassubstrat in vivo. Med tanke på graden av bevarande av kaspasgener över metazoer bör det vara möjligt att anpassa detta protokoll till kaspaser från andra organismer också.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Dr. Elif Kamber-Kaya för hennes hjälp med att upprätta protokollet i labbet. Dr Guy Salvesen gav vänligt DriceC211A mutant9. Detta arbete finansierades av en MIRA-utmärkelse från National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) vid National Institutes of Health (NIH) under bidragsnummer 2R35GM118330. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesignen, datainsamlingen och analysen, beslutet att publicera eller förberedelsen av manuskriptet.
Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | |
Anti-His antibody | Sigma-Aldrich | MA1-21315 | |
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell signaling | 7076P2 | |
Anti-Myc antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell signaling | 7074P2 | |
Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
BioPhotometer | Eppendorf | #6131 | |
BL21 (DE3) pLysS Competent Cells | Promega | L1195 | |
Centrifuge rotor | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023-1G | |
ChemiDoc with image software | Bio-Rad | Universal Hood II | For Chemiluminiscence imaging |
Chemiluminiscence Substrate | Thermofisher Scientific | 34095 | For Chemiluminiscence imaging |
Cleaved Drosophila ICE (drICE) (Asp230) Antibody | Cell Signaling Technology | 9478S | |
Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955128 | Used to measure bacterial growth and protein concentration |
Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610610 | |
Erlenmeyer flasks, 1000 mL | Millipore sigma | CLS49801L | For LB agar media preparation and autoclaving |
Erlenmeyer flasks, 250 mL | Millipore sigma | CLS4980250 | For bacterial culture growth and induction. |
Ethylene-diamine-tetra-acetic Acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
Gel tank SDS-PAGE system | Thermofisher Scientific | STM1001 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermofisher scientific | 87786 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
His-Drice-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
His-DriceC211A-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
His-Dronc-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
His-DroncC318A-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | |
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermofisher Scientific | FERR0392 | |
Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | |
LB Agar, Miller (Powder) | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
Lysozyme | Thermofisher Scientific | 90082 | |
Microbiological plate incubator | Fisher Scientific | 11-690-650D | For colony growth after transformation |
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 22363611 | |
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | |
Midiprep kit | Qiagen | 12243 | |
Mini tube rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 | for mixing bacterial lysates and Ni-NTA agarose |
Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
Motorized Pipette Controller | Gilson | F110120 | For using serological pipettes |
NaH2PO4 | Fisher Scientific | BP330-1 | |
Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Midi Protein Gel, 20-well | Thermofisher Scientific | WG1402BOX | |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermofisher Scientific | NP0007 | |
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20x) | Thermofisher Scientific | NP0001 | |
NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Invitrogen | NP00061 | |
Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | C25 incubator shaker | |
Petridish 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Plating beads | Zymo research | S1001 | For spreading culture on AmpR/KanR plates |
Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | 34924 | For purification of His-tagged proteins |
Precision Plus Protein Standards | Bio-Rad | #161-0374 | |
Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | #5000006 | |
pT7CFE1-NMyc | Thermofisher Scientific | 88863 | For cloning substrates for RRL expression |
PVDF membrane | Invitrogen | LC2007 | |
14 mL Polypropylene round bottom tubes | Fisher Scientific | 352029 | For growing plasmid cultures |
QiaRack | Qiagen | 19095 | For holding polypropylene columns during purification |
Refrigerated High speed Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | |
rRNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N251A | For RRL expression |
Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
Sterile Falcon tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
Sterile Falcon tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S70903-250G | |
1 mL Serological Pipets, Sterile | celltreat | 229001B | For bacterial cell lysis in 50 mL tubes |
TnT Coupled Reticulocyte Lysate -T7 | Promega | L4611 | |
Tris-base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Waterbath | Fisher Scientific | 2340 | |
Western wet transferring cassette | Thermofisher Scientific | STM2001 |