JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Imunologia e Infecção

En flowcytometribaseret teknik med høj gennemstrømning til screening af integrinhæmmende lægemidler

Published: February 02, 2024
doi:
10.3791/64401
, , , ,
1Department of Immunology, School of Medicine,UConn Health, 2Center for Molecular Discovery,University of New Mexico Health Sciences Center, 3Comprehensive Cancer Center,University of New Mexico Health Sciences Center, 4Department of Pathology,University of New Mexico Health Sciences Center, 5Autophagy, Inflammation, & Metabolism (AIM) Center,University of New Mexico

Summary

Denne protokol beskriver en flowcytometribaseret screeningsmetode med høj kapacitet til identifikation af småmolekylelægemidler, der hæmmer β2-integrinaktivering på humane neutrofiler.

Abstract

Denne protokol sigter mod at etablere en metode til identifikation af små molekylære antagonister af β2 integrinaktivering ved hjælp af konformationsændringsrapporterende antistoffer og high-throughput flowcytometri. Metoden kan også tjene som vejledning for andre antistofbaserede screeningsmetoder med høj kapacitet. β2-integriner er leukocytspecifikke adhæsionsmolekyler, der er afgørende for immunresponser. Neutrofiler er afhængige af integrinaktivering for at forlade blodbanen, ikke kun for at bekæmpe infektioner, men også for at være involveret i flere inflammatoriske sygdomme. Kontrol af β2 integrinaktivering præsenterer en levedygtig tilgang til behandling af neutrofilassocierede inflammatoriske sygdomme. I denne protokol anvendes et monoklonalt antistof, mAb24, som specifikt binder til hovedstykket med høj affinitet af β2-integriner, til at kvantificere β2-integrinaktivering på isolerede primære humane neutrofiler. N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanin (fMLP) anvendes som stimulus til aktivering af neutrofile β2-integriner. Et flowcytometer med høj kapacitet, der automatisk kunne køre 384-brønds pladeprøver, blev anvendt i denne undersøgelse. Virkningerne af 320 kemikalier på β2 integrinhæmning vurderes inden for 3 timer. Molekyler, der direkte målretter β2-integriner eller målmolekyler i G-proteinkoblede receptorinitierede integrin indefra og ud-aktiveringssignalveje, kan identificeres gennem denne tilgang.

Introduction

Mange inflammatoriske sygdomme er karakteriseret ved infiltration af neutrofiler på stedet for hævelse eller skade1. For at infiltrere disse væv skal neutrofiler fuldføre neutrofilrekrutteringskaskaden, hvilket indebærer anholdelse til endotelet, ekstravasation over karvæggen og rekruttering i vævet2. Cirkulerende neutrofiler har brug for β2 integrinaktivering for at fuldføre denne kaskade, især til anholdelsesfasen. Således kan integrinhæmmende lægemidler, der reducerer neutrofiladhæsion, ekstravasation og rekruttering, effektivt behandle inflammatoriske sygdomme 3,4.

β2 integriner har været målrettet mod inflammatoriske sygdomme før. Efalizumab, et monoklonalt antistof, der er direkte rettet mod integrin αLβ2, blev udviklet til behandling af psoriasis5. Efalizumab blev imidlertid seponeret på grund af dets dødelige bivirkning – progressiv multifokal leukoencefalopati som følge af JC-virusreaktivering 6,7. Nye antiinflammatoriske integrinbaserede terapier bør overveje at opretholde leukocytternes antiinfektionsfunktioner for at minimere bivirkninger. Bivirkningerne af efalizumab kan skyldes den langvarige cirkulation af monoklonale antistoffer i blodbanen, hvilket kan hæmme immunfunktionerne på lang sigt8. En nylig undersøgelse viser, at efalizumab medierer αLβ2 tværbinding og uønsket internalisering af α4 integriner, hvilket giver en alternativ forklaring på bivirkningerne9. Således kan kortvarige antagonister med små molekyler undgå dette problem.

En high-throughput metode til screening af småmolekylære β2 integrinantagonister ved hjælp af humane neutrofiler præsenteres her. β2 integrinaktivering kræver konformationelle ændringer af integrin-ektodomænet for at få adgang til og øge dets bindingsaffinitet til dets ligand. I den kanoniske switchblade-model strækker det bøjede lukkede integrin-ektodomæne sig først til en udvidet lukket konformation og åbner derefter sit hovedstykke til en fuldt aktiveret udvidet åben konformation10,11,12,13. Der er også en alternativ vej, der starter fra den bøjede-lukkede til bøjet-åben og udvidet-åben, til sidst 14,15,16,17,18,19. Det kropsbygningsspecifikke antistof mAb24 binder sig til en epitop i det humane β2-I-lignende domæne, når ektodomænets hovedstykke er åbent20,21,22,23.

Her bruges mAb24-APC til at bestemme, om β2-integrinerne er aktiveret. For at aktivere neutrofiler og integrin anvendes N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanin (fMLP), et bakterielt afledt kort kemotaktisk peptid, der kan aktivere neutrofile β2-integriner24, som en stimulus i denne protokol. Når fMLP binder til Fpr1 på neutrofiler, aktiveres downstream-signalkaskader, der involverer G-proteiner, phospholipase Cβ og phosphoinositid 3-kinase γ. Disse signalhændelser resulterer i sidste ende i integrinaktivering via indefra-ud-signalvejen18,25. Udover små molekyleantagonister, der direkte binder til β2-integriner og forhindrer konformationelle ændringer af integrinaktivering26, vil forbindelser, der kan hæmme komponenter i β2-integrin-indefra-ud-aktiveringssignalvejen, også blive detekteret med denne metode. Automatiserede flowcytometre muliggør screening med høj kapacitet. Identifikation af nye antagonister kan ikke kun uddybe vores forståelse af integrinfysiologi, men også give translationel indsigt i integrinbaseret antiinflammationsbehandling.

Protocol

Hepariniserede fuldblodsprøver blev opnået fra afidentificerede raske humane donorer efter at have opnået informeret samtykke, som godkendt af Institutional Review Board of UConn Health, efter principperne i Helsinki-erklæringen. Der blev indhentet informeret samtykke fra alle donorer. Inklusions-/eksklusionskriterierne for denne undersøgelse blev omhyggeligt udviklet for at sikre deltagernes egnethed og for at minimere potentielle risici. Berettigede deltagere var mellem 18 og 65 år, af enhver etnicitet, flydende …

Representative Results

Data fra en repræsentativ 384-brønds pladescreening (figur 4) afslørede, at negative kontroller havde en MFI på mAb24-APC på 3236 ± 110, mens positive kontroller havde en MFI på mAb24-APC på 7588 ± 858. Z’-faktoren for denne plade er ca. 0,33, hvilket er inden for et acceptabelt interval31. Z’ kræver dog yderligere validering i sekundære assays. For at normalisere dataene blev alle værdier skaleret til at tildele en maksimal væ…

Discussion

Initiering og ophør af neutrofil stimulering og farvning bestemmes ved tilsætning af neutrofiler og det fikserende PFA. Derfor er det afgørende at sikre det samme tidsinterval mellem pipettering af neutrofiler eller PFA i hver kolonne. Dette sikrer, at stimulerings- og farvningstiden for neutrofiler fra hver brønd forbliver konsistent. På grund af neutrofilernes korte levetid skal hele eksperimentet, fra indsamling af blod fra donorer til færdiggørelse af flowcytometri, udføres samme dag. Neutrofiler er meget fø…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Dr. Evan Jellison og Li Zhu i flowcytometrikernen på UConn Health for deres hjælp med flowcytometri, Dr. Lynn Puddington i Institut for Immunologi ved UConn Health for hendes støtte til instrumenterne, Slawa Gajewska og Dr. Paul Appleton i den kliniske forskningskerne ved UConn Health for deres hjælp med at få blodprøver. Vi anerkender Dr. Christopher “Kit” Bonin og Dr. Geneva Hargis fra UConn School of Medicine for deres hjælp med videnskabelig skrivning og redigering af dette manuskript. Denne forskning blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (P20GM121176), USA, en karriereudviklingspris fra American Heart Association (18CDA34110426) og en opstartsfond fra UConn Health. Figur 1 blev oprettet med BioRender.com.

Materials

16-channel pipettes Thermo 4661090N Instrument
384-well plate Greiner 784201 Materials
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24 BioLegend 363410 Reagents
Bravo Automated Liquid Handling Platform  Agilent 16050-102 384 multi-channel liquid handler
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
FlowJo Becton, Dickinson & Company NA Software
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Lifitegrast Thermofisher  50-208-2121 Reagents
Nexinhib20 Tocris 6089 Reagents
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) Sigma F3506 Reagents
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
Plate shaker  Fisher 88-861-023 Instrument
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) Reagents
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM) Prestwick Chemical Libraries Ver19_384 1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)
RPMI 1640 Medium, no phenol red Gibco 11-835-030 Reagents
Swing-bucket rotor  Eppendorf A-4-62 Rotor
ZE5 Cell Analyzer Bio-Rad Laboratories Model ZE5 Instrument
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Herrero-Cervera, A., Soehnlein, O., Kenne, E. Neutrophils in chronic inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 19 (2), 177-191 (2022).
  2. Sadik, C. D., Kim, N. D., Luster, A. D. Neutrophils cascading their way to inflammation. Trends in immunology. 32 (10), 452-460 (2011).
  3. Mitroulis, I. et al. Leukocyte integrins: Role in leukocyte recruitment and as therapeutic targets in inflammatory disease. Pharmacology & Therapeutics. 147, 123-135 (2015).
  4. Slack, R. J., Macdonald, S. J. F., Roper, J. A., Jenkins, R. G., Hatley, R. J. D. Emerging therapeutic opportunities for integrin inhibitors. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (1), 60-78 (2022).
  5. Frampton, J. E., Plosker, G. L. Efalizumab. American Journal of Clinical Dermatology. 10 (1), 51-72 (2009).
  6. Talamonti, M. et al. Efalizumab. Expert Opinion on Drug Safety. 10 (2), 239-251 (2011).
  7. Saribaş, A. S., Özdemir, A., Lam, C., Safak, M. JC virus-induced progressive multifocal leukoencephalopathy. Future Virology. 5 (3), 313-323 (2010).
  8. Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 220-233 (2009).
  9. Mancuso, R. V., Casper, J., Schmidt, A. G., Krähenbühl, S., Weitz-Schmidt, G. Anti-αLβ2 antibodies reveal novel endocytotic cross-modulatory functionality. British Journal of Pharmacology. 177 (12), 2696-2711 (2020).
  10. Anderson, J. M., Li, J., Springer, T. A. Regulation of integrin α5β1 conformational states and intrinsic affinities by metal ions and the ADMIDAS. Molecular Biology of the Cell. 33 (6), ar56 (2022).
  11. Jensen, R. K. et al. Complement receptor 3 forms a compact high-affinity complex with iC3b. The Journal of Immunology. 206 (12), 3032-3042 (2021).
  12. Li, J., Yan, J., Springer, T. A. Low affinity integrin states have faster ligand binding kinetics than the high affinity state. Elife. 10, e73359 (2021).
  13. Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annual Review of Immunology. 25, 619-647 (2007).
  14. Fan, Z. et al. Neutrophil recruitment limited by high-affinity bent β2 integrin binding ligand in cis. Nature communications. 7 (1), 1-14 (2016).
  15. Fan, Z. et al. High-affinity bent β2-integrin molecules in arresting neutrophils face each other through binding to ICAMs in cis. Cell reports. 26 (1), 119-130 (2019).
  16. Gupta, V. et al. The β-tail domain (βTD) regulates physiologic ligand binding to integrin CD11b/CD18. Blood. 109 (8), 3513-3520 (2006).
  17. Sen, M., Yuki, K., Springer, T. A. An internal ligand-bound, metastable state of a leukocyte integrin, αXβ2. Journal of Cell Biology. 203 (4), 629-642 (2013).
  18. Sun, H., Hu, L., Fan, Z. β2 integrin activation and signal transduction in leukocyte recruitment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 321 (2), C308-C316 (2021).
  19. Sun, H., Zhi, K., Hu, L., Fan, Z. The activation and regulation of β2 integrins in phagocytes. Frontiers in Immunology. 12, 978 (2021).
  20. Kamata, T. et al. The role of the CPNKEKEC sequence in the β2 subunit I domain in regulation of integrin αLβ2 (LFA-1). The Journal of Immunology. 168 (5), 2296-2301 (2002).
  21. Lu, C., Shimaoka, M., Zang, Q., Takagi, J., Springer, T. A. Locking in alternate conformations of the integrin αLβ2 I domain with disulfide bonds reveals functional relationships among integrin domains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2393-2398 (2001).
  22. Yang, W., Shimaoka, M., Chen, J., Springer, T. A. Activation of integrin β-subunit I-like domains by one-turn C-terminal α-helix deletions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (8), 2333-2338 (2004).
  23. Dransfield, I., Hogg, N. Regulated expression of Mg2+ binding epitope on leukocyte integrin alpha subunits. The EMBO Journal. 8 (12), 3759-3765 (1989).
  24. Torres, M., Hall, F., O'neill, K. Stimulation of human neutrophils with formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine induces tyrosine phosphorylation and activation of two distinct mitogen-activated protein-kinases. The Journal of Immunology. 150 (4), 1563-1577 (1993).
  25. Dorward, D. A. et al. The role of formylated peptides and formyl peptide receptor 1 in governing neutrophil function during acute inflammation. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1172-1184 (2015).
  26. Lin, F. Y. et al. A general chemical principle for creating closure-stabilizing integrin inhibitors. Cell. 185 (19), 3533-3550 (2022).
  27. Lizcano, A. et al. Erythrocyte sialoglycoproteins engage Siglec-9 on neutrophils to suppress activation. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 129 (23), 3100-3110 (2017).
  28. Tadema, H., Abdulahad, W. H., Stegeman, C. A., Kallenberg, C. G., Heeringa, P. Increased expression of Toll-like receptors by monocytes and natural killer cells in ANCA-associated vasculitis. PloS One. 6 (9), e24315 (2011).
  29. Nagelkerke, S. Q., aan de Kerk, D. J., Jansen, M. H., van den Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Failure to detect functional neutrophil B helper cells in the human spleen. PloS one. 9 (2), e88377 (2014).
  30. Blanco-Camarillo, C., Alemán, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Frontiers in Immunology. 12, 672520 (2021).
  31. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of biomolecular screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  32. Shimaoka, M., Salas, A., Yang, W., Weitz-Schmidt, G., Springer, T.A. Small molecule integrin antagonists that bind to the β2 subunit I-like domain and activate signals in one direction and block them in the other. Immunity. 19 (3), 391-402 (2003).
  33. Liu, W. et al. Nexinhib20 Inhibits neutrophil adhesion and β2 integrin activation by antagonizing Rac-1-Guanosine 5′-Triphosphate interaction. The Journal of Immunology. 209 (8), 1574-1585 (2022).
  34. Robinson, M. et al. Antibody against the Leu-CAM beta-chain (CD18) promotes both LFA-1-and CR3-dependent adhesion events. The Journal of Immunology. 148 (4), 1080-1085 (1992).
  35. Lu, C., Ferzly, M., Takagi, J., Springer, T. A. Epitope mapping of antibodies to the C-terminal region of the integrin β2 subunit reveals regions that become exposed upon receptor activation. The Journal of Immunology. 166 (9), 5629-5637 (2001).
  36. Mauler, M. et al. Platelet serotonin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via neutrophil degranulation. circulation. 139 (7), 918-931 (2019).
  37. Shen, X. F., Cao, K., Jiang, J., Guan, W. X., Du, J. F. Neutrophil dysregulation during sepsis: an overview and update. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (9), 1687-1697 (2017).
  38. Chiang, C. C., Cheng, W. J., Korinek, M., Lin, C. Y., Hwang, T. L. Neutrophils in Psoriasis. Frontiers in Immunology. 10, 02376 (2019).
  39. Lood, C. et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  40. Bazzoni, G., Shih, D. T., Buck, C. A., Hemler, M. E. Monoclonal antibody 9EG7 defines a novel β1 integrin epitope induced by soluble ligand and manganese, but inhibited by calcium. Journal of Biological Chemistry. 270 (43), 25570-25577 (1995).
  41. Luque, A. et al. Activated conformations of very late activation integrins detected by a group of antibodies (HUTS) specific for a novel regulatory region(355-425) of the common β1 chain. Journal of Biological Chemistry. 271 (19), 11067-11075 (1996).
  42. Mould, A. P., Akiyama, S. K., Humphries, M. J. The inhibitory Anti-β1 integrin monoclonal antibody 13 recognizes an epitope that is attenuated by ligand occupancy: evidence for allosteric inhibition of integrin function. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20365-20374 (1996).
  43. Spiess, M. et al. Active and inactive β1 integrins segregate into distinct nanoclusters in focal adhesions. Journal of Cell Biology. 217 (6), 1929-1940 (2018).
  44. Yang, S. et al. Relating conformation to function in integrin α5β1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), E3872-E3881 (2016).
  45. Shattil, S. J., Hoxie, J. A., Cunningham, M., Brass, L. F. Changes in the platelet membrane glycoprotein IIb.IIIa complex during platelet activation. Journal of Biological Chemistry. 260 (20), 11107-11114 (1985).
  46. Shattil, S. J., Motulsky, H. J , Insel, P. A., Flaherty, L., Brass, L. F. Expression of fibrinogen receptors during activation and subsequent desensitization of human platelets by epinephrine. Blood. 68 (6), 1224-1231 (1986).
  47. Carreño, R. et al. 2E8 binds to the high affinity i-domain in a metal ion-dependent manner: a second generation monoclonal antibody selectively targeting activated LFA-1. Journal of Biological Chemistry. 285 (43), 32860-32868 (2010).
  48. Keizer, G. D., Visser, W., Vliem, M., Figdor, C. G. A monoclonal antibody (NKI-L16) directed against a unique epitope on the alpha-chain of human leukocyte function-associated antigen 1 induces homotypic cell-cell interactions. The Journal of Immunology. 140 (5), 1393-1400 (1988).
  49. Lefort, C. T. et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119 (18), 4275-4282 (2012).
  50. van Kooyk, Y. et al. Activation of LFA-1 through a Ca2(+)-dependent epitope stimulates lymphocyte adhesion. Journal of Cell Biology. 112 (2), 345-354 (1991).
  51. Mould, A. P. et al. Conformational changes in the integrin a domain provide a mechanism for signal transduction via hybrid domain movement. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17028-17035 (2003).
  52. Chigaev, A. et al. Real-time analysis of conformation-sensitive antibody binding provides new insights into integrin conformational regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (21), 14337-14346 (2009).
  53. Njus, B. H. et al. Conformational mAb as a tool for integrin ligand discovery. Assay and Drug Development Technologies. 7 (5), 507-515 (2009).
  54. Chigaev, A., Wu, Y., Williams, D. B., Smagley, Y., Sklar, L. A. Discovery of very late antigen-4 (VLA-4, α4β1 integrin) allosteric antagonists. Journal of Biological Chemistry. 286 (7), 5455-5463 (2011).
  55. Ghigo, A., De Santi, C., Hart, M., Mitash, N., Swiatecka-Urban, A. Cell signaling and regulation of CFTR expression in cystic fibrosis cells in the era of high efficiency modulator therapy. Journal of Cystic Fibrosis. 22, S12-S16 (2023).
  56. Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B.J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (1), 29-36 (2014).

Tags

Flow CytometryHigh-throughput ScreeningIntegrin InhibitorBeta-2 IntegrinNeutrophilAnti-inflammatoryConformational Change AntibodyFMLPGPCR

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Cao, Z., Garcia, M. J., Sklar, L. A., Wandinger-Ness, A., Fan, Z. A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs. J. Vis. Exp. (204), e64401, doi:10.3791/64401 (2024).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image