פלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה לתרבית והדמיה תלת-ממדית של אורגנואידים
Summary
מאמר זה מציג פרוטוקול ייצור לסוג חדש של מצע תרבית עם מאות מיקרו-מיכלים למ”מ2, שבו ניתן לגדל אורגנואידים בתרבית ולצפות בהם באמצעות מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. פרוטוקולי זריעת התאים ומערכת החיסון מפורטים גם הם.
Abstract
אפיון מספר רב של תרביות אורגנוטיפיות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) בסקאלות רזולוציה שונות מוגבל כיום על ידי גישות הדמיה סטנדרטיות. פרוטוקול זה מתאר דרך להכין שבבי תרבית אורגנואידים מיקרו-מפוברקים, המאפשרים הדמיה חיה תלת-ממדית בקנה מידה רב-ממדי במכשיר ידידותי למשתמש הדורש מניפולציות מינימליות ומסוגל לתפוקת הדמיה של עד 300 אורגנואידים/שעה. שבבי תרבית אלה תואמים הן למטרות אוויר והן למטרות טבילה (אוויר, מים, שמן וסיליקון) ולמגוון רחב של מיקרוסקופים נפוצים (למשל, דיסק מסתובב, סורק נקודתי קונפוקלי, שדה רחב ושדה בהיר). יתר על כן, ניתן להשתמש בהם עם שיטות גיליון אור כגון טכנולוגיית מיקרוסקופ הארה חד-אובייקטיבי וחד-מישורי (SPIM) (soSPIM).
הפרוטוקול המתואר כאן נותן צעדים מפורטים להכנת שבבי התרבית המיקרו-מפוברקים ולתרבית והצביעה של אורגנואידים. רק פרק זמן קצר נדרש כדי להכיר, וניתן למצוא בקלות חומרים מתכלים וציוד במעבדות ביולוגיות רגילות. כאן, יכולות ההדמיה התלת-ממדית יודגמו רק באמצעות מיקרוסקופים סטנדרטיים מסחריים (למשל, דיסק מסתובב לשחזור תלת-ממדי ומיקרוסקופ שדה רחב לניטור שגרתי).
Introduction
בתרביות תאים תלת-ממדיות אורגנוטיפיות, המכונות להלן אורגנואידים, תאי גזע מתמיינים ומתארגנים בעצמם למבנים מרחביים החולקים דמיון מורפולוגי ותפקודי חזק עם איברים אמיתיים. אורגנואידים מציעים מודלים יקרי ערך לחקר הביולוגיה האנושית והתפתחות מחוץ לגוף 1,2,3. מספר גדל והולך של מודלים מפותחים המחקים את הכבד, המוח, הכליות, הריאות ואיברים רבים אחרים 2,4,5. התמיינות באורגנואידים מכוונת על ידי תוספת של גורמי גדילה מסיסים ומטריצת חוץ תאיים ברצף זמן מדויק. עם זאת, בניגוד בולט לאיברים, התפתחות אורגנואידים היא הטרוגנית למדי.
מעבר לאתגרים ביולוגיים רבים6,7, תרביות אורגנואידים מציבות אתגרים טכנולוגיים גם מבחינת שיטות תרביות תאים, אפיון שעתוק והדמיה. התפתחות איברים In vivo מתרחשת בסביבה ביולוגית הגורמת לארגון עצמי סטריאוטיפי ביותר של סידורי תאים. כל שינוי פנוטיפי יכול לשמש כפרוקסי לאבחון מצב חולה. לעומת זאת, אורגנואידים מתפתחים במבחנה במיקרו-סביבות מבוקרות מינימליות התואמות לתנאי תרבית תאים, וכתוצאה מכך נוצרת שונות גדולה בנתיב ההתפתחות ובהיווצרות הצורה עבור כל אורגנואיד בודד.
מחקר8 שנערך לאחרונה הראה כי הדמיה כמותית של צורת אורגנואידים (מתארי פנוטיפ) בשילוב עם הערכה של כמה סמנים גנטיים מאפשרים הגדרה של נופי התפתחות פנוטיפיים. ניתן לטעון כי היכולת לקשר בין מגוון הביטוי הגנומי באורגנואידים לבין התנהגותם הפנוטיפית היא צעד חשוב לקראת שחרור מלוא הפוטנציאל של תרבויות אורגנוטיפיות. לפיכך, היא מבקשת לפתח גישות הדמיה ייעודיות בעלות תוכן גבוה המאפשרות אפיון תכונות אורגנואידים בקנה מידה תת-תאי, רב-תאי ואורגנואיד שלם בתלת-ממד 9,10.
פיתחנו פלטפורמה רב-תכליתית לסינון תוכן גבוה (HCS) המאפשרת תרבית אורגנואידים יעילה (החל מתאי גזע עובריים אנושיים מבודדים [hESCs], תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם [hIPSCs], או תאים ראשוניים ועד אורגנואידים תלת-ממדיים, רב-תאיים ומובחנים) והדמיה תלת-ממדית מהירה ולא פולשנית. הוא משלב מכשיר תרבית תאים תלת-ממדי ממוזער מהדור הבא, הנקרא שבב JeWells ( השבב להלן), המכיל אלפי מיקרו-בארות ערוכות היטב ומשני צדיהן מראות 45° המאפשרות הדמיה מהירה, תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ אור11 חד-אובייקטיבי. מערכת זו, התואמת לכל מיקרוסקופ הפוך מסחרי סטנדרטי, מאפשרת הדמיה של 300 אורגנואידים בתלת-ממד ברזולוציה תת-תאית תוך <1 שעות.
המיקרו-ייצור של התקן תרבית התאים מתחיל מתבנית מיקרו-מובנית קיימת, שמכילה מאות מיקרו-פירמידות (איור 1A) עם בסיס מרובע ודפנות צדדיות ב-45° ביחס לבסיס. איור 1C מראה תמונות של מבנים כאלה במיקרוסקופ אלקטרונים (EM). התבנית עצמה עשויה פולי(דימתילסילוקסן) (PDMS) וניתן ליצור אותה כהעתק של תבנית ראשונית (לא מוצגת כאן) עם תכונות מתאימות (כחללים) באמצעות הליכים ליתוגרפיים רכים סטנדרטיים. התבנית העיקרית יכולה להיות מיוצרת על ידי הליכים שונים. זה ששימש לפרוטוקול זה נעשה באמצעות תחריט רטוב סיליקון כפי שדווח Galland et al. 11; הליך ייצור התבנית הראשונית אינו קריטי לפרוטוקול זה. הפירמידות מסודרות במערך בריבוע, עם אותו גובה עבור כיווני X ו- Y (במקרה זה המגרש הוא 350 מיקרומטר).
לשם המחשה, פורסמו ניסויי הוכחת היתכנות12 כדי להדגים כי השבב מאפשר תרבית ארוכת טווח (חודשים) ופרוטוקולי התמיינות תוך הגדרה מדויקת של מספר התאים הראשוניים בבארות. פיתוח אישי של מספר רב של אורגנואידים יכול להיות מנוטר באופן אוטומטי בשידור חי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי של שדה בהיר וגיליון אור תלת-ממדי. יתר על כן, ניתן לאחזר אורגנואידים כדי לבצע חקירות ביולוגיות נוספות (למשל, אנליזה תעתיקית). מאמר זה מתאר פרוטוקולים מפורטים לייצור כיסויי תרבית תאים, הליך הזריעה והצביעה במיקרוסקופ פלואורסצנטי, כמו גם שליפת האורגנואידים.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההליך לייצור צלחת תרבית המיקרווול, המאפשרת תרבית אורגנואידים בצפיפות גבוהה והתמיינות, תואר במאמר זה. בשל הגיאומטריה והסידור של המיקרו-חללים, אלפי ספרואידים ניתנים לתרבית ולהכתמה בצלחת אחת לפרקי זמן ארוכים (מספר שבועות או יותר) כמעט ללא אובדן חומר. לשם השוואה, שטח של 4 מ”מ x 2 מ”מ על צלחת תרבית…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר נתמך על ידי פרויקט CALIPSO הנתמך על ידי קרן המחקר הלאומית, משרד ראש הממשלה, סינגפור, במסגרת תוכנית קמפוס למצוינות במחקר ויזמות טכנולוגית (CREATE). V.V. מודה על תמיכתם של חוקר NRF NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, מימון סיד MBI ו- ANR ADGastrulo. א.ב. וג.ג. מודים על התמיכה ממימון הליבה של MBI. א.ב. מודה לאנדור טכנולוגיות על השאלת המיקרוסקופ BC43.
Materials
| 2-Propanol | Thermofisher scientific | AA19397K7 | |
| Acetone | Thermofisher scientific | AA19392K7 | |
| BC43 Benchtop Confocal Microscope | Andor Technology | spinning disk confocal microscope | |
| bovine serum albumin | Thermofisher scientific | 37525 | |
| Buffered oxide etching solution | Merck | 901621-1L | |
| CEE Spin Coater | Brewer Science | 200X | |
| DAPI | Thermofisher scientific | 62248 | |
| Developer AZ400K | Merck | 18441223164 | |
| DI Milliq water | Millipore | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10082147 | |
| Glass coverslips | Marienfled | 117650 | 1.5H, round 25 mm diameter |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| Imaris software | BitPlane | image analysis software | |
| Inverted Transmission optical microscope | Nikon | TSF100-F | |
| Labsonic M | Sartorius Stedium Biotech | Ultrasonic homogenizer | |
| Lipidure | NOF America | CM5206 | bio-mimetic copolymer |
| NOA73 | Norland Products | 17-345 | UV curable adhesive |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Phalloidin | Thermofisher scientific | A12379 | Alexa Fluor |
| Phosphate Buffer Solution | Thermofisher scientific | 10010023 | |
| Photo Resist AZ5214E | Merck | 14744719710 | |
| Pico Plasma tool | Diener Electronic GmbH + Co. KG | Pico Plasma | For O2 plasma treatment |
| RapiClear 1.52 | Sunjin lab | RC 152001 | water-soluble clearing agent |
| RCT Hot Plate/Stirrer | IKA (MY) | ||
| Reactive Ion Etching tool | Samco Inc. (JPN) | RIE-10NR | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875093 | culture medium for HCT116 cells |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | surfactant |
| Trypsin EDTA | Thermofisher scientific | 15400054 | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | CPX2800 | |
| UV-KUB 2 | KLOE | UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density | |
| UV mask aligner | SUSS Microtec Semiconductor (DE) | MJB4 |
Referências
- Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Takebe, T., Wells James, M. Organoids by design. Science. 364 (6444), 956-959 (2019).
- Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- O’Connell, L., Winter, D. C. Organoids: past learning and future directions. Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).
- Vives, J., Batlle-Morera, L. The challenge of developing human 3D organoids into medicines. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 72 (2020).
- Busslinger, G. A., et al. The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies. Open Biology. 10 (4), 190274 (2020).
- Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Galland, R., et al. 3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).
- Beghin, A., et al. High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype. bioRxiv. , (2021).
- Beghin, A., et al. Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification. Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).
