オルガノイドの培養および3Dイメージングのためのハイスループットプラットフォーム
Summary
この論文は、オルガノイドを培養し、高解像度顕微鏡を使用して観察できる、mm2あたり数百のマイクロコンテナを備えた新しいタイプの培養基質の製造プロトコルを提示します。細胞播種および免疫染色プロトコルも詳述されています。
Abstract
さまざまな解像度スケールでの多数の3次元(3D)器官型培養物(オルガノイド)の特性評価は、現在、標準的なイメージングアプローチによって制限されています。このプロトコルは、微細加工されたオルガノイド培養チップを調製する方法を説明しており、最小限の操作を必要とし、最大300オルガノイド/hのイメージングスループットが可能なユーザーフレンドリーな装置でマルチスケールの3Dライブイメージングを可能にします。これらの培養チップは、空気対物レンズと液浸対物レンズ(空気、水、油、シリコーン)の両方、および幅広い一般的な顕微鏡(スピニングディスク、ポイントスキャナー共焦点、広視野、明視野など)と互換性があります。さらに、単一対物レンズ、単一平面照明顕微鏡(SPIM)技術(soSPIM)などのライトシートモダリティで使用できます。
ここで説明するプロトコルは、微細加工された培養チップの調製、およびオルガノイドの培養と染色のための詳細な手順を示しています。慣れるのに必要な時間は短く、消耗品や機器は通常のバイオラボで簡単に見つけることができます。ここでは、3Dイメージング機能は、市販の標準顕微鏡(3D再構成用のスピニングディスクやルーチンモニタリング用の広視野顕微鏡など)でのみ実証されます。
Introduction
オルガノイドと呼ばれるオルガノタイプ3D細胞培養では、幹細胞は分化し、実際の臓器と強い形態学的および機能的類似性を共有する空間構造に自己組織化します。オルガノイドは、ヒトの生物学と体外での発生を研究するための貴重なモデルを提供します1,2,3。肝臓、脳、腎臓、肺、および他の多くの臓器を模倣するモデルが増えています2,4,5。オルガノイドの分化は、可溶性成長因子と細胞外マトリックスを正確な時系列で添加することによって指示されます。しかしながら、臓器とは著しく対照的に、オルガノイドの発達は非常に不均一である。
多くの生物学的課題6,7に加えて、オルガノイド培養は、細胞培養方法、トランスクリプトミクスの特性評価、およびイメージングの面でも技術的な課題をもたらします。in vivo器官の発達は生物学的環境で起こり、その結果、細胞配置の非常にステレオタイプの自己組織化がもたらされます。任意の表現型の変化は、罹患状態を診断するための代理として使用することができる。対照的に、オルガノイドは、細胞培養条件に適合する最小限の制御された微小環境でin vitroで発達するため、個々のオルガノイドの発生経路と形状形成に大きなばらつきが生じます。
最近の研究8では、いくつかの遺伝子マーカーの評価と組み合わせたオルガノイド形状(表現型記述子)の定量的イメージングにより、表現型発生ランドスケープの定義が可能になることが実証されました。おそらく、オルガノイドのゲノム発現の多様性を表現型挙動と関連付ける能力は、オルガノイド培養の可能性を最大限に引き出すための大きな一歩です。したがって、細胞下、多細胞、および全オルガノイドスケールでのオルガノイドの特徴を3D 9,10で特徴付けることを可能にする、専用のハイコンテントイメージングアプローチの開発が求められています。
当社は、合理化されたオルガノイド培養(単離されたヒト胚性幹細胞[hESC]、ヒト人工多能性幹細胞[hIPSC]、または初代細胞から3D、多細胞、分化型オルガノイドまで)と高速で非侵襲的な3Dイメージングを可能にする汎用性の高いハイコンテントスクリーニング(HCS)プラットフォームを開発しました。これは、JeWellsチップ(以下、 チップ )と呼ばれる次世代の小型3D細胞培養装置を統合しており、45°ミラーに隣接する何千ものウェルアレイマイクロウェルを含み、単一対物レンズライトシート顕微鏡による高速3D高解像度イメージングを可能にします11。標準的な市販の倒立顕微鏡と互換性のあるこのシステムは、300種類のオルガノイドを3Dでイメージングし、細胞内分解能を<1時間で行うことができます。
細胞培養デバイスの微細加工は、正方形のベースとベースに対して45°の側壁を持つ数百のマイクロピラミッド(図1A)を含む既存の微細構造モールドから始まります。 図1C は、このような構造の電子顕微鏡(EM)像を示す。モールド自体はポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)でできており、標準的なソフトリソグラフィー手順を使用して、対応する機能(キャビティとして)を備えた一次モールド(ここには示されていません)のレプリカキャストとして作成できます。一次金型は、さまざまな手順で製造できます。このプロトコルに使用されたものは、Gallandらで報告されているように、シリコンウェットエッチングを使用して作成されました。11;一次金型の製造手順は、このプロトコルにとって重要ではありません。ピラミッドは、X方向とY方向で同じピッチで正方形の配列に配置されます(この場合、ピッチは350μmです)。
実例として、チップがウェル内の初期細胞数を正確に定義しながら、長期培養(月)および分化プロトコルを可能にすることを実証するために、概念実証実験12 が公開された。多数のオルガノイドの個々の発達は、標準的な明視野および3Dライトシート蛍光顕微鏡を使用してライブで自動的に監視できます。さらに、オルガノイドを取り出して、さらなる生物学的調査(例えば、トランスクリプトミクス解析)を実行することができる。この論文では、細胞培養カバーガラスの作製、蛍光顕微鏡のシードおよび染色手順、およびオルガノイドの検索に関する詳細なプロトコルについて概説します。
Protocol
Representative Results
Discussion
高密度オルガノイド培養と分化を可能にするマイクロウェル培養皿の作製手順は、この論文に記載されています。微小空洞の形状と配置により、数千のスフェロイドを1枚のプレートで長期間(数週間以上)培養および染色することができ、材料の損失はほとんどありません。比較として、細胞培養プレート上の4 mm x 2 mmの領域には、12 cm x 8 cmの面積を持つ単一の384ウェルプレートと同じ数のス?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、シンガポールの首相官邸にある国立研究財団が支援するCALIPSOプロジェクトによって、研究卓越性と技術企業のためのキャンパス(CREATE)プログラムの下でサポートされています。V.V.は、NRFの調査員NRF-NRFI2018-07、MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005、MBIシード資金、およびANR ADGasttruloの支援を認めています。A.B.とG.G.は、MBIコア資金からの支援を認めています。A.B.は、BC43顕微鏡の貸与についてAndor Technologiesを認めています。
Materials
| 2-Propanol | Thermofisher scientific | AA19397K7 | |
| Acetone | Thermofisher scientific | AA19392K7 | |
| BC43 Benchtop Confocal Microscope | Andor Technology | spinning disk confocal microscope | |
| bovine serum albumin | Thermofisher scientific | 37525 | |
| Buffered oxide etching solution | Merck | 901621-1L | |
| CEE Spin Coater | Brewer Science | 200X | |
| DAPI | Thermofisher scientific | 62248 | |
| Developer AZ400K | Merck | 18441223164 | |
| DI Milliq water | Millipore | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10082147 | |
| Glass coverslips | Marienfled | 117650 | 1.5H, round 25 mm diameter |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| Imaris software | BitPlane | image analysis software | |
| Inverted Transmission optical microscope | Nikon | TSF100-F | |
| Labsonic M | Sartorius Stedium Biotech | Ultrasonic homogenizer | |
| Lipidure | NOF America | CM5206 | bio-mimetic copolymer |
| NOA73 | Norland Products | 17-345 | UV curable adhesive |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Phalloidin | Thermofisher scientific | A12379 | Alexa Fluor |
| Phosphate Buffer Solution | Thermofisher scientific | 10010023 | |
| Photo Resist AZ5214E | Merck | 14744719710 | |
| Pico Plasma tool | Diener Electronic GmbH + Co. KG | Pico Plasma | For O2 plasma treatment |
| RapiClear 1.52 | Sunjin lab | RC 152001 | water-soluble clearing agent |
| RCT Hot Plate/Stirrer | IKA (MY) | ||
| Reactive Ion Etching tool | Samco Inc. (JPN) | RIE-10NR | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875093 | culture medium for HCT116 cells |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | surfactant |
| Trypsin EDTA | Thermofisher scientific | 15400054 | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | CPX2800 | |
| UV-KUB 2 | KLOE | UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density | |
| UV mask aligner | SUSS Microtec Semiconductor (DE) | MJB4 |
Referências
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