Высокопроизводительная платформа для культуры и 3D-визуализации органоидов
Summary
В этой статье представлен протокол изготовления нового типа культуральной подложки с сотнями микроконтейнеров намм2, в котором органоиды можно культивировать и наблюдать с помощью микроскопии высокого разрешения. Протоколы посева клеток и иммуноокрашивания также детализированы.
Abstract
Характеристика большого количества трехмерных (3D) оловоорганических культур (органоидов) в различных масштабах разрешения в настоящее время ограничена стандартными подходами к визуализации. Этот протокол описывает способ подготовки микрофабрикированных чипов органоидных культур, которые обеспечивают многомасштабную 3D-визуализацию в реальном времени на удобном для пользователя инструменте, требующем минимальных манипуляций и способном к пропускной способности до 300 органоидов в час. Эти микросхемы культуры совместимы как с воздушными, так и с погружными объективами (воздух, вода, масло и силикон) и широким спектром распространенных микроскопов (например, вращающийся диск, конфокальный точечный сканер, широкое поле и яркое поле). Кроме того, они могут использоваться с модальностями светового листа, такими как технология однообъективной одноплоскостной микроскопии освещения (SPIM) (soSPIM).
Протокол, описанный здесь, дает подробные этапы для приготовления микрофабрикированных чипов культуры, а также культивирования и окрашивания органоидов. Для ознакомления требуется лишь небольшой промежуток времени, а расходные материалы и оборудование можно легко найти в обычных биолабораториях. Здесь возможности 3D-визуализации будут продемонстрированы только с помощью коммерческих стандартных микроскопов (например, вращающийся диск для 3D-реконструкции и широкоугольная микроскопия для рутинного мониторинга).
Introduction
В органотипических 3D-клеточных культурах, далее называемых органоидами, стволовые клетки дифференцируются и самоорганизуются в пространственные структуры, которые имеют сильное морфологическое и функциональное сходство с реальными органами. Органоиды предлагают ценные модели для изучения биологии человека и развития вне организма 1,2,3. Все большее число моделей разрабатывается, которые имитируют печень, мозг, почки, легкие и многие другие органы 2,4,5. Дифференцировка в органоидах направляется добавлением растворимых факторов роста и внеклеточного матрикса в точной временной последовательности. Однако в отличие от органов, развитие органоидов довольно неоднородно.
Помимо многочисленных биологических проблем 6,7, органоидные культуры также создают технологические проблемы с точки зрения методов культивирования клеток, характеристики транскриптомики и визуализации. Развитие органов in vivo происходит в биологической среде, что приводит к крайне стереотипной самоорганизации клеточных устройств. Любое фенотипическое изменение может быть использовано в качестве прокси для диагностики болезненного состояния. Напротив, органоиды развиваются in vitro в минимально контролируемых микросредах, совместимых с условиями клеточной культуры, что приводит к большой изменчивости пути развития и формирования формы для каждого отдельного органоида.
Недавнее исследование8 показало, что количественная визуализация органоидной формы (дескрипторы фенотипа) в сочетании с оценкой нескольких генетических маркеров позволяет определить фенотипические ландшафты развития. Можно утверждать, что способность соотносить разнообразие геномной экспрессии в органоидах с их фенотипическим поведением является важным шагом на пути к раскрытию всего потенциала органотипических культур. Таким образом, это требует разработки специализированных подходов к визуализации с высоким содержанием, позволяющих характеризовать органоидные особенности в субклеточных, многоклеточных и цельноорганоидных масштабах в 3D 9,10.
Мы разработали универсальную платформу скрининга с высоким содержанием (HCS), позволяющую оптимизировать органоидную культуру (от изолированных эмбриональных стволовых клеток человека [hESCs], индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток [hIPSC] или первичных клеток до 3D, многоклеточных, дифференцированных органоидов) и быструю, неинвазивную 3D-визуализацию. Он интегрирует миниатюрное устройство 3D-культуры клеток следующего поколения, называемое чипом JeWells ( чип ниже), которое содержит тысячи хорошо расположенных микролунок, окруженных зеркалами 45°, которые позволяют быстро получать 3D-изображения с высоким разрешением с помощью однообъективной световой листовой микроскопии11. Совместимая с любым стандартным, коммерческим, инвертированным микроскопом, эта система позволяет визуализировать 300 органоидов в 3D с субклеточным разрешением за <1 ч.
Микропроизводство устройства для культивирования клеток начинается с существующей микроструктурированной формы, которая содержит сотни микропирамид (рисунок 1А) с квадратным основанием и боковыми стенками под углом 45° по отношению к основанию. На рисунке 1С показаны изображения таких структур в электронном микроскопе (ЭМ). Сама форма изготовлена из поли(диметилсилоксана) (PDMS) и может быть изготовлена в виде реплики отливки первичной формы (не показана здесь) с соответствующими характеристиками (в виде полостей) с использованием стандартных мягко-литографических процедур. Первичная форма может быть изготовлена различными процедурами. Тот, который использовался для этого протокола, был сделан с использованием кремниевого влажного травления, как сообщалось в Galland et al. 11; процедура изготовления первичной формы не является критической для этого протокола. Пирамиды расположены в квадратном массиве, с одинаковым шагом для направлений X и Y (в этом случае шаг составляет 350 мкм).
В качестве иллюстрации были опубликованы экспериментальные эксперименты12 , чтобы продемонстрировать, что чип допускает долгосрочную культуру (месяцы) и протоколы дифференцировки, точно определяя количество начальных ячеек в скважинах. Индивидуальное развитие большого количества органоидов может автоматически контролироваться в режиме реального времени с помощью стандартных ярко-полевых и 3D-флуоресцентных микроскопов. Кроме того, органоиды могут быть извлечены для выполнения дальнейших биологических исследований (например, транскриптомного анализа). В этой статье описываются подробные протоколы изготовления покровных пластинок клеточной культуры, процедура посева и окрашивания для флуоресцентной микроскопии, а также извлечение органоидов.
Protocol
Representative Results
Discussion
В данной работе описана процедура изготовления чашки для микроскважинной культуры, которая позволяет культивировать и дифференцировать органоиды высокой плотности. Благодаря геометрии и расположению микрополот, тысячи сфероидов могут быть культивированы и окрашены в одну пластину …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследование поддерживается проектом CALIPSO, поддерживаемым Национальным исследовательским фондом, канцелярией премьер-министра Сингапура, в рамках его программы Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE). V.V. признает поддержку исследователя NRF NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, начального финансирования MBI и ANR ADGastrulo. A.B. и G.G. признают поддержку со стороны основного финансирования MBI. A.B. выражает признательность Andor Technologies за предоставление в аренду микроскопа BC43.
Materials
| 2-Propanol | Thermofisher scientific | AA19397K7 | |
| Acetone | Thermofisher scientific | AA19392K7 | |
| BC43 Benchtop Confocal Microscope | Andor Technology | spinning disk confocal microscope | |
| bovine serum albumin | Thermofisher scientific | 37525 | |
| Buffered oxide etching solution | Merck | 901621-1L | |
| CEE Spin Coater | Brewer Science | 200X | |
| DAPI | Thermofisher scientific | 62248 | |
| Developer AZ400K | Merck | 18441223164 | |
| DI Milliq water | Millipore | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10082147 | |
| Glass coverslips | Marienfled | 117650 | 1.5H, round 25 mm diameter |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| Imaris software | BitPlane | image analysis software | |
| Inverted Transmission optical microscope | Nikon | TSF100-F | |
| Labsonic M | Sartorius Stedium Biotech | Ultrasonic homogenizer | |
| Lipidure | NOF America | CM5206 | bio-mimetic copolymer |
| NOA73 | Norland Products | 17-345 | UV curable adhesive |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Phalloidin | Thermofisher scientific | A12379 | Alexa Fluor |
| Phosphate Buffer Solution | Thermofisher scientific | 10010023 | |
| Photo Resist AZ5214E | Merck | 14744719710 | |
| Pico Plasma tool | Diener Electronic GmbH + Co. KG | Pico Plasma | For O2 plasma treatment |
| RapiClear 1.52 | Sunjin lab | RC 152001 | water-soluble clearing agent |
| RCT Hot Plate/Stirrer | IKA (MY) | ||
| Reactive Ion Etching tool | Samco Inc. (JPN) | RIE-10NR | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875093 | culture medium for HCT116 cells |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | surfactant |
| Trypsin EDTA | Thermofisher scientific | 15400054 | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | CPX2800 | |
| UV-KUB 2 | KLOE | UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density | |
| UV mask aligner | SUSS Microtec Semiconductor (DE) | MJB4 |
Referências
- Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Takebe, T., Wells James, M. Organoids by design. Science. 364 (6444), 956-959 (2019).
- Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- O’Connell, L., Winter, D. C. Organoids: past learning and future directions. Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).
- Vives, J., Batlle-Morera, L. The challenge of developing human 3D organoids into medicines. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 72 (2020).
- Busslinger, G. A., et al. The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies. Open Biology. 10 (4), 190274 (2020).
- Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Galland, R., et al. 3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).
- Beghin, A., et al. High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype. bioRxiv. , (2021).
- Beghin, A., et al. Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification. Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).
