В этой статье представлен протокол изготовления нового типа культуральной подложки с сотнями микроконтейнеров намм2, в котором органоиды можно культивировать и наблюдать с помощью микроскопии высокого разрешения. Протоколы посева клеток и иммуноокрашивания также детализированы.
Характеристика большого количества трехмерных (3D) оловоорганических культур (органоидов) в различных масштабах разрешения в настоящее время ограничена стандартными подходами к визуализации. Этот протокол описывает способ подготовки микрофабрикированных чипов органоидных культур, которые обеспечивают многомасштабную 3D-визуализацию в реальном времени на удобном для пользователя инструменте, требующем минимальных манипуляций и способном к пропускной способности до 300 органоидов в час. Эти микросхемы культуры совместимы как с воздушными, так и с погружными объективами (воздух, вода, масло и силикон) и широким спектром распространенных микроскопов (например, вращающийся диск, конфокальный точечный сканер, широкое поле и яркое поле). Кроме того, они могут использоваться с модальностями светового листа, такими как технология однообъективной одноплоскостной микроскопии освещения (SPIM) (soSPIM).
Протокол, описанный здесь, дает подробные этапы для приготовления микрофабрикированных чипов культуры, а также культивирования и окрашивания органоидов. Для ознакомления требуется лишь небольшой промежуток времени, а расходные материалы и оборудование можно легко найти в обычных биолабораториях. Здесь возможности 3D-визуализации будут продемонстрированы только с помощью коммерческих стандартных микроскопов (например, вращающийся диск для 3D-реконструкции и широкоугольная микроскопия для рутинного мониторинга).
В органотипических 3D-клеточных культурах, далее называемых органоидами, стволовые клетки дифференцируются и самоорганизуются в пространственные структуры, которые имеют сильное морфологическое и функциональное сходство с реальными органами. Органоиды предлагают ценные модели для изучения биологии человека и развития вне организма 1,2,3. Все большее число моделей разрабатывается, которые имитируют печень, мозг, почки, легкие и многие другие органы 2,4,5. Дифференцировка в органоидах направляется добавлением растворимых факторов роста и внеклеточного матрикса в точной временной последовательности. Однако в отличие от органов, развитие органоидов довольно неоднородно.
Помимо многочисленных биологических проблем 6,7, органоидные культуры также создают технологические проблемы с точки зрения методов культивирования клеток, характеристики транскриптомики и визуализации. Развитие органов in vivo происходит в биологической среде, что приводит к крайне стереотипной самоорганизации клеточных устройств. Любое фенотипическое изменение может быть использовано в качестве прокси для диагностики болезненного состояния. Напротив, органоиды развиваются in vitro в минимально контролируемых микросредах, совместимых с условиями клеточной культуры, что приводит к большой изменчивости пути развития и формирования формы для каждого отдельного органоида.
Недавнее исследование8 показало, что количественная визуализация органоидной формы (дескрипторы фенотипа) в сочетании с оценкой нескольких генетических маркеров позволяет определить фенотипические ландшафты развития. Можно утверждать, что способность соотносить разнообразие геномной экспрессии в органоидах с их фенотипическим поведением является важным шагом на пути к раскрытию всего потенциала органотипических культур. Таким образом, это требует разработки специализированных подходов к визуализации с высоким содержанием, позволяющих характеризовать органоидные особенности в субклеточных, многоклеточных и цельноорганоидных масштабах в 3D 9,10.
Мы разработали универсальную платформу скрининга с высоким содержанием (HCS), позволяющую оптимизировать органоидную культуру (от изолированных эмбриональных стволовых клеток человека [hESCs], индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток [hIPSC] или первичных клеток до 3D, многоклеточных, дифференцированных органоидов) и быструю, неинвазивную 3D-визуализацию. Он интегрирует миниатюрное устройство 3D-культуры клеток следующего поколения, называемое чипом JeWells ( чип ниже), которое содержит тысячи хорошо расположенных микролунок, окруженных зеркалами 45°, которые позволяют быстро получать 3D-изображения с высоким разрешением с помощью однообъективной световой листовой микроскопии11. Совместимая с любым стандартным, коммерческим, инвертированным микроскопом, эта система позволяет визуализировать 300 органоидов в 3D с субклеточным разрешением за <1 ч.
Микропроизводство устройства для культивирования клеток начинается с существующей микроструктурированной формы, которая содержит сотни микропирамид (рисунок 1А) с квадратным основанием и боковыми стенками под углом 45° по отношению к основанию. На рисунке 1С показаны изображения таких структур в электронном микроскопе (ЭМ). Сама форма изготовлена из поли(диметилсилоксана) (PDMS) и может быть изготовлена в виде реплики отливки первичной формы (не показана здесь) с соответствующими характеристиками (в виде полостей) с использованием стандартных мягко-литографических процедур. Первичная форма может быть изготовлена различными процедурами. Тот, который использовался для этого протокола, был сделан с использованием кремниевого влажного травления, как сообщалось в Galland et al. 11; процедура изготовления первичной формы не является критической для этого протокола. Пирамиды расположены в квадратном массиве, с одинаковым шагом для направлений X и Y (в этом случае шаг составляет 350 мкм).
В качестве иллюстрации были опубликованы экспериментальные эксперименты12 , чтобы продемонстрировать, что чип допускает долгосрочную культуру (месяцы) и протоколы дифференцировки, точно определяя количество начальных ячеек в скважинах. Индивидуальное развитие большого количества органоидов может автоматически контролироваться в режиме реального времени с помощью стандартных ярко-полевых и 3D-флуоресцентных микроскопов. Кроме того, органоиды могут быть извлечены для выполнения дальнейших биологических исследований (например, транскриптомного анализа). В этой статье описываются подробные протоколы изготовления покровных пластинок клеточной культуры, процедура посева и окрашивания для флуоресцентной микроскопии, а также извлечение органоидов.
В данной работе описана процедура изготовления чашки для микроскважинной культуры, которая позволяет культивировать и дифференцировать органоиды высокой плотности. Благодаря геометрии и расположению микрополот, тысячи сфероидов могут быть культивированы и окрашены в одну пластину …
The authors have nothing to disclose.
Исследование поддерживается проектом CALIPSO, поддерживаемым Национальным исследовательским фондом, канцелярией премьер-министра Сингапура, в рамках его программы Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE). V.V. признает поддержку исследователя NRF NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, начального финансирования MBI и ANR ADGastrulo. A.B. и G.G. признают поддержку со стороны основного финансирования MBI. A.B. выражает признательность Andor Technologies за предоставление в аренду микроскопа BC43.
2-Propanol | Thermofisher scientific | AA19397K7 | |
Acetone | Thermofisher scientific | AA19392K7 | |
BC43 Benchtop Confocal Microscope | Andor Technology | spinning disk confocal microscope | |
bovine serum albumin | Thermofisher scientific | 37525 | |
Buffered oxide etching solution | Merck | 901621-1L | |
CEE Spin Coater | Brewer Science | 200X | |
DAPI | Thermofisher scientific | 62248 | |
Developer AZ400K | Merck | 18441223164 | |
DI Milliq water | Millipore | ||
Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10082147 | |
Glass coverslips | Marienfled | 117650 | 1.5H, round 25 mm diameter |
Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
Imaris software | BitPlane | image analysis software | |
Inverted Transmission optical microscope | Nikon | TSF100-F | |
Labsonic M | Sartorius Stedium Biotech | Ultrasonic homogenizer | |
Lipidure | NOF America | CM5206 | bio-mimetic copolymer |
NOA73 | Norland Products | 17-345 | UV curable adhesive |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
Phalloidin | Thermofisher scientific | A12379 | Alexa Fluor |
Phosphate Buffer Solution | Thermofisher scientific | 10010023 | |
Photo Resist AZ5214E | Merck | 14744719710 | |
Pico Plasma tool | Diener Electronic GmbH + Co. KG | Pico Plasma | For O2 plasma treatment |
RapiClear 1.52 | Sunjin lab | RC 152001 | water-soluble clearing agent |
RCT Hot Plate/Stirrer | IKA (MY) | ||
Reactive Ion Etching tool | Samco Inc. (JPN) | RIE-10NR | |
RPMI 1640 | Invitrogen | 11875093 | culture medium for HCT116 cells |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS |
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | surfactant |
Trypsin EDTA | Thermofisher scientific | 15400054 | |
Ultrasonic Cleaner | Bransonic | CPX2800 | |
UV-KUB 2 | KLOE | UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density | |
UV mask aligner | SUSS Microtec Semiconductor (DE) | MJB4 |