Eine Hochdurchsatzplattform für Kultur und 3D-Bildgebung von Organoiden
Summary
In dieser Arbeit wird ein Herstellungsprotokoll für eine neue Art von Kultursubstrat mit Hunderten von Mikrobehältern promm2 vorgestellt, in dem Organoide kultiviert und mittels hochauflösender Mikroskopie beobachtet werden können. Die Zellimpf- und Immunfärbungsprotokolle sind ebenfalls detailliert.
Abstract
Die Charakterisierung einer großen Anzahl von dreidimensionalen (3D) organotypischen Kulturen (Organoiden) auf unterschiedlichen Auflösungsskalen ist derzeit durch Standard-Bildgebungsansätze begrenzt. Dieses Protokoll beschreibt eine Möglichkeit zur Herstellung von mikrofabrizierten Organoid-Kulturchips, die eine Multiskalen-3D-Live-Bildgebung auf einem benutzerfreundlichen Instrument ermöglichen, das minimale Manipulationen erfordert und einen Bilddurchsatz von bis zu 300 Organoiden pro Stunde ermöglicht. Diese Kulturchips sind sowohl mit Luft- als auch mit Immersionsobjektiven (Luft, Wasser, Öl und Silikon) und einer Vielzahl gängiger Mikroskope (z. B. rotierende Scheibe, Punktscanner konfokal, Weitfeld und Hellfeld) kompatibel. Darüber hinaus können sie mit Light-Sheet-Modalitäten wie der Single-Objective, Single-Plane-Illumination-Mikroskopie-Technologie (SPIM) (soSPIM) verwendet werden.
Das hier beschriebene Protokoll enthält detaillierte Schritte für die Herstellung der mikrofabrizierten Kulturchips und die Kultur und Färbung von Organoiden. Es ist nur eine kurze Zeit erforderlich, um sich daran zu gewöhnen, und Verbrauchsmaterialien und Geräte können in normalen Biolaboren leicht gefunden werden. Hier werden die 3D-Bildgebungsmöglichkeiten nur mit kommerziellen Standardmikroskopen demonstriert (z. B. Spinning Disk für die 3D-Rekonstruktion und Weitfeldmikroskopie für die Routineüberwachung).
Introduction
In organotypischen 3D-Zellkulturen, im Folgenden als Organoide bezeichnet, differenzieren sich Stammzellen und organisieren sich selbst zu räumlichen Strukturen, die starke morphologische und funktionelle Ähnlichkeiten mit realen Organen aufweisen. Organoide bieten wertvolle Modelle, um die menschliche Biologie und Entwicklung außerhalb des Körpers zu untersuchen 1,2,3. Es werden immer mehr Modelle entwickelt, die Leber, Gehirn, Niere, Lunge und viele andere Organe nachahmen 2,4,5. Die Differenzierung in Organoiden erfolgt durch die Zugabe von löslichen Wachstumsfaktoren und einer extrazellulären Matrix in einer präzisen zeitlichen Abfolge. Im Gegensatz zu Organen ist die Entwicklung von Organoiden jedoch recht heterogen.
Neben zahlreichen biologischen Herausforderungen 6,7 stellen Organoidkulturen auch technologische Herausforderungen in Bezug auf Zellkulturmethoden, Charakterisierung der Transkriptomik und Bildgebung dar. Die In-vivo-Organentwicklung findet in einer biologischen Umgebung statt, die zu einer hochgradig stereotypen Selbstorganisation von Zellanordnungen führt. Jede phänotypische Veränderung kann als Proxy verwendet werden, um einen erkrankten Zustand zu diagnostizieren. Im Gegensatz dazu entwickeln sich Organoide in vitro in minimal kontrollierten Mikroumgebungen, die mit Zellkulturbedingungen kompatibel sind, was zu einer großen Variabilität im Entwicklungspfad und de der Formbildung für jedes einzelne Organoid führt.
Eine aktuelle Studie8 zeigte, dass die quantitative Abbildung der Organoidform (Phänotyp-Deskriptoren) in Verbindung mit der Bewertung einiger genetischer Marker die Definition phänotypischer Entwicklungslandschaften ermöglicht. Die Fähigkeit, die Vielfalt der genomischen Expression in Organoiden mit ihrem phänotypischen Verhalten in Beziehung zu setzen, ist wohl ein wichtiger Schritt, um das volle Potenzial organotypischer Kulturen freizusetzen. Daher bittet es um die Entwicklung von dedizierten, hochinhaltlichen Bildgebungsansätzen, die die Charakterisierung von organoiden Merkmalen auf subzellulären, multizellulären und ganzorganoiden Skalen in 3D 9,10 ermöglichen.
Wir haben eine vielseitige High-Content-Screening-Plattform (HCS) entwickelt, die eine optimierte Organoidkultur (von isolierten humanen embryonalen Stammzellen [hESCs], humaninduzierten pluripotenten Stammzellen [hIPSCs] oder Primärzellen bis hin zu mehrzelligen, differenzierten 3D-Organoiden) und eine schnelle, nicht-invasive 3D-Bildgebung ermöglicht. Es integriert ein miniaturisiertes 3D-Zellkulturgerät der nächsten Generation, den sogenannten JeWells-Chip (im Folgenden der Chip ), der Tausende von gut angeordneten Mikrotiterplatten enthält, die von 45°-Spiegeln flankiert werden, die eine schnelle, hochauflösende 3D-Bildgebung durch Einzelobjektiv-Lichtblattmikroskopie ermöglichen11. Dieses System ist kompatibel mit jedem handelsüblichen, inversen Mikroskop und ermöglicht die Abbildung von 300 Organoiden in 3D mit subzellulärer Auflösung in <1 h.
Die Mikrofabrikation der Zellkulturvorrichtung geht von einer vorhandenen mikrostrukturierten Form aus, die Hunderte von Mikropyramiden (Abbildung 1A) mit einer quadratischen Basis und Seitenwänden in einem Winkel von 45° zur Basis enthält. Abbildung 1C zeigt elektronenmikroskopische (EM) Aufnahmen solcher Strukturen. Die Form selbst besteht aus Poly(dimethylsiloxan) (PDMS) und kann als Nachbildung einer Primärform (hier nicht gezeigt) mit entsprechenden Merkmalen (als Hohlräume) unter Verwendung von Standard-Soft-Lithographie-Verfahren hergestellt werden. Die Primärform kann durch verschiedene Verfahren hergestellt werden. Dasjenige, das für dieses Protokoll verwendet wurde, wurde unter Verwendung von Silizium-Nassätzen hergestellt, wie in Galland et al. berichtet. 11; Das Verfahren zur Herstellung der Primärform ist für dieses Protokoll nicht kritisch. Die Pyramiden sind in einem quadratischen Array angeordnet, mit dem gleichen Abstand für die X- und Y-Richtung (in diesem Fall beträgt der Abstand 350 μm).
Zur Veranschaulichung wurden Proof-of-Concept-Experimente12 veröffentlicht, um zu zeigen, dass der Chip Langzeitkultur- (Monate) und Differenzierungsprotokolle ermöglicht und gleichzeitig die Anzahl der Anfangszellen in den Vertiefungen genau definiert. Die individuelle Entwicklung einer großen Anzahl von Organoiden kann mit Standard-Hellfeld- und 3D-Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopen automatisch live überwacht werden. Darüber hinaus können Organoide für weitere biologische Untersuchungen (z.B. Transkriptomanalysen) gewonnen werden. In diesem Artikel werden detaillierte Protokolle für die Herstellung der Zellkultur-Deckgläser, das Seeding- und Färbeverfahren für die Fluoreszenzmikroskopie sowie die Gewinnung der Organoide beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Verfahren zur Herstellung der Mikrotiterkulturschale, die eine hochdichte Organoidkultur und -differenzierung ermöglicht, wurde in dieser Arbeit beschrieben. Aufgrund der Geometrie und Anordnung der Mikrokavitäten können Tausende von Sphäroiden über lange Zeiträume (mehrere Wochen oder länger) nahezu ohne Materialverlust in einer einzigen Platte kultiviert und gefärbt werden. Zum Vergleich: Eine Fläche von 4 mm x 2 mm auf der Zellkulturplatte kann so viele Sphäroide enthalten wie eine einzelne 384-Well-Plat…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Forschung wird durch das CALIPSO-Projekt unterstützt, das von der National Research Foundation, Büro des Premierministers, Singapur, im Rahmen ihres Programms Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE) unterstützt wird. V.V. bedankt sich für die Unterstützung des NRF-Ermittlers NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, MBI-Seed-Finanzierung und ANR ADGastrulo. A.B. und G.G. bedanken sich für die Unterstützung durch die MBI-Grundfinanzierung. A.B. bedankt sich bei Andor Technologies für die Leihgabe des BC43-Mikroskops.
Materials
| 2-Propanol | Thermofisher scientific | AA19397K7 | |
| Acetone | Thermofisher scientific | AA19392K7 | |
| BC43 Benchtop Confocal Microscope | Andor Technology | spinning disk confocal microscope | |
| bovine serum albumin | Thermofisher scientific | 37525 | |
| Buffered oxide etching solution | Merck | 901621-1L | |
| CEE Spin Coater | Brewer Science | 200X | |
| DAPI | Thermofisher scientific | 62248 | |
| Developer AZ400K | Merck | 18441223164 | |
| DI Milliq water | Millipore | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10082147 | |
| Glass coverslips | Marienfled | 117650 | 1.5H, round 25 mm diameter |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| Imaris software | BitPlane | image analysis software | |
| Inverted Transmission optical microscope | Nikon | TSF100-F | |
| Labsonic M | Sartorius Stedium Biotech | Ultrasonic homogenizer | |
| Lipidure | NOF America | CM5206 | bio-mimetic copolymer |
| NOA73 | Norland Products | 17-345 | UV curable adhesive |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Phalloidin | Thermofisher scientific | A12379 | Alexa Fluor |
| Phosphate Buffer Solution | Thermofisher scientific | 10010023 | |
| Photo Resist AZ5214E | Merck | 14744719710 | |
| Pico Plasma tool | Diener Electronic GmbH + Co. KG | Pico Plasma | For O2 plasma treatment |
| RapiClear 1.52 | Sunjin lab | RC 152001 | water-soluble clearing agent |
| RCT Hot Plate/Stirrer | IKA (MY) | ||
| Reactive Ion Etching tool | Samco Inc. (JPN) | RIE-10NR | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875093 | culture medium for HCT116 cells |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | surfactant |
| Trypsin EDTA | Thermofisher scientific | 15400054 | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | CPX2800 | |
| UV-KUB 2 | KLOE | UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density | |
| UV mask aligner | SUSS Microtec Semiconductor (DE) | MJB4 |
Referências
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