זיקה תאית של תחליב מיוצב חלקיקים להגברת הפנמת האנטיגן
Summary
כדי לתכנן באופן רציונלי אדג’ובנטים יעילים, פיתחנו תחליב פיקרינג (PNPE) של חומצה פולי-לקטית-קו-גליקולית עם ננו-חלקיקים מיוצבים. ה-PNPE היה בעל רכות ייחודית וממשק הידרופובי למגע תאי רב עוצמה והציע העמסת אנטיגן בעלת תכולה גבוהה, שיפור הזיקה התאית של מערכת ההעברה לתאים המציגים אנטיגן וגרימת הפנמה יעילה של אנטיגנים.
Abstract
הזיקה התאית של מיקרו/ננו-חלקיקים היא התנאי המקדים לזיהוי תאי, ספיגה תאית והפעלה, החיוניים להעברת תרופות ולתגובה חיסונית. המחקר הנוכחי נבע מהתצפית כי ההשפעות של מטען, גודל וצורה של חלקיקים מוצקים על זיקת התא נחשבות בדרך כלל, אך לעתים רחוקות אנו מבינים את התפקיד החיוני של רכות, תופעת ארגון מחדש דינמי ואינטראקציה מורכבת של ממשקים באהדה תאית. כאן, פיתחנו תחליב פיקרינג (PNPE) עם חומצה פולי-לקטית-קו-גליקולית (PLGA) מיוצב על-ידי ננו-חלקיקים שהתגבר על החסרונות של צורות קשיחות ודימה את הגמישות והנזילות של פתוגנים. הוקמה שיטה לבדיקת הזיקה של PNPE לפני השטח של התאים ולהרחבה על ההפנמה שלאחר מכן על ידי תאי מערכת החיסון. הזיקה של PNPE לשלפוחיות חוץ-תאיות ביו-מימטיות (bEVs) – התחליף לתאים דנדריטיים של מח עצם (BMDCs) – נקבעה באמצעות מיקרו-איזון גבישי קוורץ עם ניטור פיזור (QCM-D), שאיפשר ניטור בזמן אמת של הידבקות תחליב-תאים. לאחר מכן, PNPE שימש כדי לספק את האנטיגן (ovalbumin, OVA) ואת ספיגת האנטיגנים על ידי BMDCs נצפתה באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal (CLSM). תוצאות מייצגות הראו כי ה-PNPE ירד באופן מיידי בתדירות (ΔF) כאשר הוא נתקל ב-bEVs, מה שמעיד על הידבקות מהירה וזיקה גבוהה של ה-PNPE ל-BMDCs. PNPE הראה קשירה חזקה יותר באופן משמעותי לקרום התא מאשר מיקרו-חלקיקים PLGA (PMPs) ואדג’ובנט AddaVax (מסומן כננו-אמולסיה מיוצב פעילי שטח [SSE]). יתר על כן, בשל הזיקה התאית המוגברת לאימונוציטים באמצעות שינויי עקמומיות דינמיים ודיפוזיות לרוחב, ספיגת האנטיגן הוגברה לאחר מכן בהשוואה ל-PMPs ו-SSE. פרוטוקול זה מספק תובנות לתכנון פורמולציות חדשניות עם זיקה גבוהה לתאים והפנמת אנטיגן יעילה, ומספק פלטפורמה לפיתוח חיסונים יעילים.
Introduction
כדי להילחם במחלות מגיפות, כרוניות ומדבקות, חובה לפתח אדג’ובנטים יעילים לחיסונים מניעתיים וטיפוליים 1,2. באופן אידיאלי, האדג’ובנטים צריכים להיות בעלי בטיחות מעולה והפעלה חיסונית 3,4,5. ספיגה יעילה ותהליך של אנטיגנים על ידי תאים המציגים אנטיגן (APCs) נחשבים לשלב חיוני במפל האיתות במורד הזרם ותחילת התגובה החיסונית 6,7,8. לפיכך, השגת הבנה ברורה של מנגנון האינטראקציה של תאי מערכת החיסון עם אנטיגנים ותכנון אדג’ובנטים להגברת ההפנמה הן אסטרטגיות יעילות להגברת היעילות של חיסונים.
מיקרו/ננו-חלקיקים בעלי תכונות ייחודיות נחקרו בעבר כמערכות העברת אנטיגן כדי לתווך את הקליטה התאית של אנטיגנים ואת האינטראקציה התאית עם תבניות מולקולריות הקשורות לפתוגנים 9,10. עם מגע עם תאים, מערכות הלידה מתחילות לקיים אינטראקציה עם המטריצה החוץ-תאית ועם קרום התא, מה שהוביל להפנמה ולתגובות תאיות לאחרמכן 11,12. מחקרים קודמים הראו כי הפנמה של חלקיקים מתרחשת באמצעות הידבקות ממברנה-חלקיקים של התא13, ולאחר מכן דפורמציה גמישה של קרום התא ודיפוזיה של הקולטן לממברנה פני השטח14,15. בנסיבות אלה, המאפיינים של מערכת האספקה תלויים בזיקה לנגמ”שים, אשר משפיעים לאחר מכן על כמות הקליטה16,17.
כדי לקבל תובנות על תכנון מערכת ההעברה לשיפור התגובה החיסונית, התמקדו מאמצים נרחבים בחקר הקשר בין תכונות החלקיקים לבין ספיגת התאים. המחקר הנוכחי נבע מהתצפית כי מיקרו/ננו-חלקיקים מוצקים בעלי מטענים, גדלים וצורות שונים נחקרים לעתים קרובות באור זה, בעוד שתפקיד הנזילות בהפנמת אנטיגן נחקר רק לעתים רחוקות18,19. למעשה, במהלך ההדבקה, החלקיקים הרכים הדגימו שינויי עקמומיות דינמיים ודיפוזיות לרוחב כדי להגדיל את שטח המגע עבור אינטראקציות רב-ערכיות, שבקושי ניתן לשכפל על ידי החלקיקים המוצקים20,21. בנוסף, קרומי התאים הם דו-שכבתיים פוספוליפידים (sphingolipids או כולסטרול) באתר הספיגה, וחומרים הידרופוביים יכולים לשנות את האנטרופיה הקונפורמציונית של שומנים, ולהפחית את כמות האנרגיה הנדרשת לקליטת תאים22,23. לכן, הגברת הניידות וקידום הידרופוביות של מערכת האספקה עשויים להיות אסטרטגיה יעילה לחיזוק הפנמת האנטיגן כדי לשפר את התגובה החיסונית.
תחליבי פיקרינג, המיוצבים על ידי חלקיקים מוצקים המורכבים בממשק שבין שני נוזלים בלתי ניתנים לערעור, היו בשימוש נרחב בתחום הביולוגי24,25. למעשה, החלקיקים הצוברים בממשק שמן/מים קובעים את הניסוח של מבנים רב-שכבתיים, המקדמים אינטראקציות רב-שכבתיות בין מערכת ההעברה לתאים, וגורמים עוד יותר לתכונות פיזיוכימיות רב-תפקודיות בהעברת תרופות. בגלל העיוות והניידות הרוחבית שלהם, תחליבי פיקרינג היו צפויים להיכנס לאינטראקציה תאית רב-ערכית עם האימונוציטים ולהיות מזוהים על ידי חלבוני הממברנה26. בנוסף, מכיוון שליבות מיצלה שמנוניות בתחליבי פיקרינג אינן מכוסות לחלוטין בחלקיקים מוצקים, תחליבי פיקרינג מכילים מרווחים בגדלים שונים בין חלקיקים בממשק השמן/מים, הגורמים להידרופוביות גבוהה יותר. לפיכך, חיוני לחקור את הזיקה של תחליבי פיקרינג לנגמ”שים ולפרט על ההפנמה שלאחר מכן כדי לפתח אדג’ובנטים יעילים.
בהתבסס על שיקולים אלה, תכננו תחליב פיקרינג (PNPE) מיוצב ננו-חלקיקים של PLGA כמערכת אספקת חיסונים לנזילות, שגם סייעה להשיג תובנות חשובות בזיקה של PNPE ל-BMDCs והפנמת תאים. ההדבקה בזמן אמת של שלפוחיות חוץ-תאיות ביו-מימטיות (bEVs; החלפה של BMDCs) ל-PNPE נותרה בשיטה נטולת תוויות באמצעות מיקרו-איזון גבישי קוורץ עם ניטור פיזור (QCM-D). בעקבות אפיון הזיקה של PNPE ל-BMDCs, נעשה שימוש במיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלית (CLSM) כדי לקבוע את ספיגת האנטיגן. התוצאה הצביעה על זיקה גבוהה יותר של PNPE ל- BMDCs, והפנמה יעילה של האנטיגן. ציפינו שה-PNPE יפגין זיקה גבוהה יותר ל-APCs, מה שעשוי לעורר טוב יותר את הפנמת האנטיגנים כדי לשפר את התגובה החיסונית.
Protocol
Representative Results
Discussion
פיתחנו תחליב שמן/מים מיוצב ננו-חלקיקים PLGA כמערכת אספקה להפנמת אנטיגן משופרת. ל-PNPE המוכן היה משטח צפוף לתמיכה בנקודת הנחיתה ורכות ונזילות ייחודיות למגע תאי חזק עם קרום תא החיסון. יתר על כן, ממשק השמן/מים הציע העמסת אנטיגן בתכולה גבוהה, ו-PLGA אמפיפילי העניק ל-PNPE יציבות גבוהה להובלת אנטיגנים לת?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט שנתמך על ידי תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), מ 0 עד 1 פרויקט חדשנות מקורי של תוכנית מחקר מדעית בסיסית של האקדמיה הסינית למדעים (ZDBS-LY-SLH040), הקרן לקבוצות מחקר חדשניות של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס ‘21821005).
Materials
| AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
| Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
| Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
| Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
| Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
| Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
| Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
| Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
| QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
| Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
| RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
| Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |
Referências
- Ma, G., Gu, Z., Wei, W. Advanced vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 183, 114170 (2022).
- Sharma, J., Carson, C. S., Douglas, T., Wilson, J. T., Joyce, S. Nano-particulate platforms for vaccine delivery to enhance antigen-specific cd8(+) t-cell response. Methods in Molecular Biology. 2412, 367-398 (2022).
- Nguyen, T. P., et al. Safety and immunogenicity of nanocovax, a sars-cov-2 recombinant spike protein vaccine: interim results of a double-blind, randomised controlled phase 1 and 2 trial. The Lancet Regional Health. Western Pacific. 24, 100474 (2022).
- Coates, E. E., et al. Safety and immunogenicity of a trivalent virus-like particle vaccine against western, eastern, and venezuelan equine encephalitis viruses: a phase 1, open-label, dose-escalation, randomised clinical trial. The Lancet Infectious Diseases. 22 (8), 1210-1220 (2022).
- Wei, L., et al. Efficacy and safety of a nanoparticle therapeutic vaccine in patients with chronic hepatitis b: a randomized clinical trial. Hepatology. 75 (1), 182-195 (2022).
- Krishnan, R., Kim, J. O., Qadiri, S. S. N., Kim, J. O., Oh, M. J. Early viral uptake and host-associated immune response in the tissues of seven-band grouper following a bath challenge with nervous necrosis virus. Fish & Shellfish Immunology. 103, 454-463 (2020).
- Mishra, D., Mishra, P. K., Dubey, V., Dabadghao, S., Jain, N. K. Evaluation of uptake and generation of immune response by murine dendritic cells pulsed with hepatitis b surface antigen-loaded elastic liposomes. Vaccine. 25 (39-40), 6939-6944 (2007).
- Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., Mccullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
- Jing, H., et al. Fluorescent artificial antigens revealed extended membrane networks utilized by live dendritic cells for antigen uptake. Nano Letters. 22 (10), 4020-4027 (2022).
- Meena, J., Goswami, D. G., Anish, C., Panda, A. K. Cellular uptake of polylactide particles induces size dependent cytoskeletal remodeling in antigen presenting cells. Biomaterials Science. 9 (23), 7962-7976 (2021).
- Yang, J., et al. Drug delivery via cell membrane fusion using lipopeptide modified liposomes. ACS Central Science. 2 (9), 621-630 (2016).
- Rawle, R., Kasson, P., Boxer, S. Disentangling viral membrane fusion from receptor binding by using synthetic dna-lipid conjugates totether influenza virus to model lipid membranes. Biophysical Journal. 111 (1), 123-131 (2016).
- Ha, H. K., Kim, J. W., Lee, M. R., Jun, W., Lee, W. J. Cellular uptake and cytotoxicity of β-lactoglobulin nanoparticles: the effects of particle size and surface charge. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 28 (3), 420-427 (2015).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Dankovich, T. M., et al. Extracellular matrix remodeling through endocytosis and resurfacing of tenascin-r. Nature Communications. 12 (1), 7129 (2021).
- Evans, E., Buxbaum, K. Affinity of red-blood-cell membrane for particle surfaces measured by the extent of particle encapsulation. Biophysical Journal. 34 (1), 1-12 (1981).
- Rohner, N. A., Purdue, L. N., Von Recum, H. A. Affinity-based polymers provide long-term immunotherapeutic drug delivery across particle size ranges optimal for macrophage targeting. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (4), 1693-1700 (2021).
- Zhou, X., Liu, Y., Wang, X. F., Li, X. M., Xiao, B. Effect of particle size on the cellular uptake and anti-inflammatory activity of oral nanotherapeutics. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 187, 110880 (2020).
- Zhang, D., et al. The morphology and surface charge-dependent cellular uptake efficiency of upconversion nanostructures revealed by single-particle optical microscopy. Chemical Science. 13 (12), 3610 (2022).
- Xi, Y. K., et al. Co2-responsive pickering emulsions stabilized by soft protein particles for interfacial biocatalysis. Chemical Science. 13 (10), 2884-2890 (2022).
- Trivedi, R. P., Klevets, I. I., Senyuk, B., Lee, T., Smalyukh, I. I. Reconfigurable interactions and three-dimensional patterning of colloidal particles and defects in lamellar soft media. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 109 (13), 4744-4749 (2012).
- De Araujo, A. D., Hoang, H. N., Lim, J., Mak, J. Y. W., Fairlie, D. P. Tuning electrostatic and hydrophobic surfaces of aromatic rings to enhance membrane association and cell uptake of peptides. Angewandte Chemie. 61 (29), 03995 (2022).
- Waku, T., et al. Effect of the hydrophilic-hydrophobic balance of antigen-loaded peptide nanofibers on their cellular uptake, cellular toxicity, and immune stimulatory properties. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3781 (2019).
- Meng, X., et al. A soft pickering emulsifier made from chitosan and peptides endows stimuli-responsiveness, bioactivity and biocompatibility to emulsion. Carbohydrate Polymers. 277, 118768 (2022).
- Wang, Z., et al. Fabrication and in vitro/vivo evaluation of drug nanocrystals self-stabilized pickering emulsion for oral delivery of quercetin. Pharmaceutics. 14 (5), 897 (2022).
- Ji, J., et al. Core-shell-structured silica/polyacrylate particles prepared by pickering emulsion: influence of the nucleation model on particle interfacial organization and emulsion stability. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 534 (2014).
- Chen, l., et al. Quantitative evaluation of proteins with bicinchoninic acid (bca): resonance raman and surface-enhanced resonance raman scattering-based methods. Analyst. 137 (24), 5834-5838 (2012).
- Colino, J., Shen, Y., Snapper, C. M. Dendritic cells pulsed with intact streptococcus pneumoniae elicit both protein- and polysaccharide-specific immunoglobulin isotype responses in vivo through distinct mechanisms. The Journal of Experimental Medicine. 195 (1), 1-13 (2002).
- Zhang, Y., Wu, J., Zhang, H., Wei, J., Wu, J. Extracellular vesicles-mimetic encapsulation improves oncolytic viro-immunotherapy in tumors with low coxsackie and adenovirus receptor. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 574007 (2020).
- Cappellano, G., Abreu, H., Casale, C., Dianzani, U., Chiocchetti, A. Nano-microparticle platforms in developing next-generation vaccines. Vaccines. 9 (6), 606 (2021).
- McClelland, R. D., Culp, T. N., Marchant, D. J. Imaging flow cytometry and confocal immunofluorescence microscopy of virus-host cell interactions. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 11, 749039 (2021).
- Konry, T., Sarkar, S., Sabhachandani, P., Cohen, N. Innovative tools and technology for analysis of single cells and cell-cell interaction. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 18 (1), 259-284 (2016).
- D’Aurelio, R., et al. A comparison of EIS and QCM nanoMIP-based sensors for morphine. Nanomaterials. 11 (12), 3360 (2021).
- Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
- Rydell, G. E., Dahlin, A. B., Hook, F., Larson, G. QCM-D studies of human norovirus VLPs binding to glycosphingolipids in supported lipid bilayers reveal strain-specific characteristics. Glycobiology. 19 (11), 1176-1184 (2009).
