Для рационального проектирования эффективных адъювантов мы разработали полимолочно-когликолевую кислоту, стабилизированную наночастицами эмульсию Пикеринга (PNPE). PNPE обладал уникальной мягкостью и гидрофобным интерфейсом для мощного клеточного контакта и предлагал высокую нагрузку антигена, улучшая клеточное сродство системы доставки к антигенпрезентирующим клеткам и вызывая эффективную интернализацию антигенов.
Клеточное сродство микро-/наночастиц является предпосылкой для клеточного распознавания, клеточного поглощения и активации, которые необходимы для доставки лекарств и иммунного ответа. Настоящее исследование вытекает из наблюдения, что влияние заряда, размера и формы твердых частиц на сродство клеток обычно рассматривается, но мы редко осознаем существенную роль мягкости, динамического явления реструктуризации и сложного интерфейсного взаимодействия в клеточном сродстве. Здесь мы разработали полимолочно-когликолевую кислоту (PLGA) наночастиц-стабилизированную эмульсию Пикеринга (PNPE), которая преодолела недостатки жестких форм и имитировала гибкость и текучесть патогенов. Был разработан метод для проверки сродства PNPE к клеточным поверхностям и разработки последующей интернализации иммунными клетками. Сродство PNPE к биомиметическим внеклеточным везикулам (bEV) – замене дендритных клеток костного мозга (BMDC) – определяли с помощью микровеса кристаллов кварца с мониторингом диссипации (QCM-D), что позволило в режиме реального времени контролировать адгезию клеточной эмульсии. Впоследствии PNPE использовался для доставки антигена (ovalbumin, OVA), а поглощение антигенов BMDC наблюдалось с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (CLSM). Репрезентативные результаты показали, что PNPE немедленно снижал частоту (ΔF), когда он сталкивался с bEV, что указывает на быструю адгезию и высокое сродство PNPE к BMDC. PNPE показал значительно более сильное связывание с клеточной мембраной, чем микрочастицы PLGA (PMP) и адъювант AddaVax (обозначаемый как сурфактант-стабилизированная наноэмульсия [SSE]). Кроме того, благодаря усиленному клеточному сродству к иммуноцитам за счет динамических изменений кривизны и боковых диффузий поглощение антигена впоследствии было увеличено по сравнению с PMP и SSE. Этот протокол дает представление о разработке новых составов с высоким сродством клеток и эффективной интернализацией антигена, обеспечивая платформу для разработки эффективных вакцин.
Для борьбы с эпидемическими, хроническими и инфекционными заболеваниями необходимо разработать эффективные адъюванты для профилактических и лечебных прививок 1,2. В идеале адъюванты должны обладать отличной безопасностью и иммунной активацией 3,4,5. Эффективное поглощение и процесс антигенов антигенпрезентирующими клетками (АПК) считаются важным этапом в нисходящих сигнальных каскадах и инициировании иммунного ответа 6,7,8. Следовательно, получение четкого понимания механизма взаимодействия иммунных клеток с антигенами и разработка адъювантов для усиления интернализации являются эффективными стратегиями повышения эффективности вакцин.
Микро-/наночастицы с уникальными свойствами были ранее исследованы как системы доставки антигенов для опосредования клеточного поглощения антигенов и клеточного взаимодействия с патоген-ассоциированными молекулярными паттернами 9,10. При контакте с клетками системы доставки начинают взаимодействовать с внеклеточным матриксом и клеточной мембраной, что приводит к интернализации и последующим клеточным ответам11,12. Предыдущие исследования показали, что интернализация частиц происходит через адгезиюклеточной мембраны-частицы 13 с последующей гибкой деформацией клеточной мембраны и диффузией рецептора к поверхностной мембране14,15. В этих условиях свойства системы доставки зависят от сродства к БТР, что впоследствии влияет на количество поглощения16,17.
Чтобы получить представление о конструкции системы доставки для улучшения иммунного ответа, обширные усилия были сосредоточены на исследовании взаимосвязи между свойствами частиц и клеточным поглощением. Настоящее исследование вытекает из наблюдения, что твердые микро-/наночастицы с различными зарядами, размерами и формами часто изучаются в этом свете, в то время как роль текучести в интернализации антигена редко исследуется18,19. Фактически, во время адгезии мягкие частицы продемонстрировали динамические изменения кривизны и боковые диффузии для увеличения площади контакта для поливалентных взаимодействий, которые вряд ли могут быть воспроизведены твердыми частицами20,21. Кроме того, клеточные мембраны представляют собой фосфолипидные бислои (сфинголипиды или холестерин) в месте поглощения, а гидрофобные вещества могут изменять конформационную энтропию липидов, уменьшая количество энергии, необходимой дляклеточного поглощения 22,23. Таким образом, усиление подвижности и содействие гидрофобности системы доставки может быть эффективной стратегией усиления интернализации антигена для усиления иммунного ответа.
Пикерирующие эмульсии, стабилизированные твердыми частицами, собранными на границе раздела между двумя несмешивающимися жидкостями, широко используются в биологической области24,25. Фактически, агрегирующие частицы на границе раздела нефть/вода определяют формирование многоуровневых структур, которые способствуют многоуровневым системам доставки и клеточным взаимодействиям и в дальнейшем индуцируют многофункциональные физико-химические свойства при доставке лекарств. Из-за их деформируемости и боковой подвижности эмульсии Пикеринга, как ожидалось, войдут в мультивалентное клеточное взаимодействие с иммуноцитами и будут распознаны мембранными белками26. Кроме того, поскольку маслянистые мицелловые ядра в эмульсиях Пикеринга не полностью покрыты твердыми частицами, эмульсии Пикеринга обладают промежутками разных размеров между частицами на границе раздела масло/вода, что вызывает более высокую гидрофобность. Таким образом, крайне важно исследовать сродство эмульсий Пикеринга к БТР и подробно остановиться на последующей интернализации для разработки эффективных адъювантов.
Основываясь на этих соображениях, мы разработали стабилизированную наночастицами эмульсию Пикеринга PLGA (PNPE) в качестве системы доставки вакцины с текучестью, которая также помогла получить ценную информацию о сродстве PNPE к BMDC и клеточной интернализации. Адгезия биомиметических внеклеточных везикул (bEV; замена BMDC) к PNPE в режиме реального времени контролировалась методом без меток с использованием микровеса кристаллов кварца с мониторингом диссипации (QCM-D). После характеристики сродства PNPE к BMDC для определения поглощения антигена была использована конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM). Результат показал более высокое сродство PNPE к BMDC и эффективную интернализацию антигена. Мы ожидали, что PNPE будет демонстрировать более высокое сродство к APC, что может лучше стимулировать интернализацию антигенов для усиления иммунных реакций.
Мы разработали стабилизированную наночастицами эмульсию масла/воды PLGA в качестве системы доставки для усиленной интернализации антигена. Подготовленный PNPE обладал плотно упакованной поверхностью для поддержки места посадки и уникальной мягкостью и текучестью для мощного клеточног…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Проектом, поддержанным Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), От 0 до 1 Оригинальный инновационный проект Программы фундаментальных передовых научных исследований Китайской академии наук (ZDBS-LY-SLH040), Фондом инновационных исследовательских групп Национального фонда естественных наук Китая (грант No 21821005).
AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |