抗原インターナリゼーションを促進する粒子安定化エマルジョンの細胞親和性
Summary
効率的なアジュバントを合理的に設計するために、ポリ乳酸-コグリコール酸ナノ粒子安定化ピッカリングエマルジョン(PNPE)を開発しました。PNPEは、強力な細胞接触のための独特の柔らかさと疎水性界面を有し、ハイコンテント抗原ローディングを提供し、抗原提示細胞への送達システムの細胞親和性を改善し、抗原の効率的な内在化を誘導した。
Abstract
マイクロ/ナノ粒子の細胞親和性は、薬物送達と免疫応答に不可欠な細胞認識、細胞取り込み、および活性化の前提条件です。本研究は、固体粒子の電荷、サイズ、形状が細胞親和性に及ぼす影響が通常考慮されるが、細胞親和性における柔らかさ、動的再構成現象、および複雑な界面相互作用の本質的な役割をほとんど認識していないという観察から生じました。ここでは、硬質形態の欠点を克服し、病原体の柔軟性と流動性をシミュレートするポリ乳酸-co-グリコール酸(PLGA)ナノ粒子安定化ピッカリングエマルジョン(PNPE)を開発しました。PNPEの細胞表面への親和性をテストし、その後の免疫細胞による内在化について詳しく説明する方法を設定しました。骨髄樹状細胞(BMDC)の代替物である生体模倣細胞外小胞(bEV)に対するPNPEの親和性を、細胞乳剤接着のリアルタイムモニタリングを可能にする散逸モニタリング付き水晶振動子マイクロバランス(QCM-D)を用いて決定した。続いて、PNPEを使用して抗原(オボアルブミン、OVA)を送達し、共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)を使用してBMDCによる抗原の取り込みを観察しました。代表的な結果は、PNPEがbEVに遭遇するとすぐに頻度(ΔF)が低下することを示し、PNPEのBMDCへの迅速な接着と高い親和性を示しました。 PNPEは、PLGA微粒子(PMP)およびAddaVaxアジュバント(界面活性剤安定化ナノエマルジョン[SSE]と表記)よりも細胞膜への有意に強い結合を示しました。さらに、動的な曲率変化と側方拡散による免疫細胞への細胞親和性の向上により、PMPやSSEと比較して抗原の取り込みが促進されました。このプロトコルは、高い細胞親和性と効率的な抗原インターナリゼーションを備えた新規製剤を設計するための洞察を提供し、効率的なワクチン開発のためのプラットフォームを提供します。
Introduction
流行病、慢性疾患、感染症と闘うためには、予防的および治療的ワクチン接種のための効果的なアジュバントを開発することが不可欠です1,2。理想的には、アジュバントは優れた安全性および免疫活性化を有するべきである3、4、5。抗原提示細胞(APC)による抗原の効果的な取り込みおよびプロセスは、下流のシグナル伝達カスケードおよび免疫応答の開始において不可欠な段階であると考えられている6、7、8。したがって、免疫細胞と抗原の相互作用のメカニズムを明確に理解し、内在化を促進するためのアジュバントを設計することは、ワクチンの効率を高めるための効率的な戦略です。
ユニークな特性を持つマイクロ/ナノ粒子は、抗原の細胞内取り込みおよび病原体関連分子パターンとの細胞相互作用を媒介する抗原送達システムとして以前に研究されてきた9,10。細胞と接触すると、送達系は細胞外マトリックスおよび細胞膜と相互作用し始め、それが内在化およびその後の細胞応答をもたらした11,12。これまでの研究では、粒子の内在化は細胞膜-粒子接着13、続いて細胞膜の柔軟な変形および表面膜への受容体の拡散によって起こることが明らかになった14,15。このような状況下では、送達システムの特性はAPCへの親和性に依存し、APCはその後、取り込み量に影響を与える16,17。
免疫応答を改善するための送達システムの設計に関する洞察を得るために、粒子の特性と細胞取り込みとの関係の調査に広範な努力が注がれてきました。本研究は、様々な電荷、サイズ、形状を有する固体マイクロ/ナノ粒子がこの観点からしばしば研究される一方で、抗原インターナリゼーションにおける流動性の役割はほとんど研究されないという観察から生じた18,19。実際、接着中、軟質粒子は動的曲率変化および横方向拡散を示し、多価相互作用の接触面積を増加させたが、これは固体粒子20,21によってほとんど複製できない。さらに、細胞膜は取り込み部位のリン脂質二重層(スフィンゴ脂質またはコレステロール)であり、疎水性物質は脂質の立体構造エントロピーを変化させ、細胞の取り込みに必要なエネルギー量を減少させる可能性があります22,23。したがって、移動度を増幅し、送達系の疎水性を促進することは、免疫応答を増強するために抗原インターナリゼーションを強化するための有効な戦略であり得る。
ピッカリングエマルジョンは、2つの非混和性液体間の界面に集合した固体粒子によって安定化され、生物学分野において広く使用されている24、25。実際、油/水界面の凝集粒子は、マルチレベルデリバリーシステムと細胞相互作用を促進し、薬物送達における多機能物理化学的特性をさらに誘導するマルチレベル構造の定式化を決定します。それらの変形能および横方向の移動度のために、ピッカリングエマルジョンは免疫細胞との多価細胞相互作用に入り、膜タンパク質によって認識されることが期待された26。さらに、ピッカリングエマルジョンの油性ミセルコアは固体粒子で完全に覆われていないため、ピッカリングエマルジョンは油/水界面の粒子間に異なるサイズのギャップを持ち、疎水性を高めます。したがって、ピカリングエマルジョンのAPCへの親和性を調査し、その後の内在化について詳しく説明して、効率的なアジュバントを開発することが重要です。
これらの考察に基づいて、我々は、PNPEのBMDCおよび細胞内在化への親和性に関する貴重な洞察を得るのにも役立つ流動性ワクチン送達システムとしてPLGAナノ粒子安定化ピッカリングエマルジョン(PNPE)を設計しました。PNPEへの生体模倣細胞外小胞(bEV、BMDCの置換)のリアルタイム接着を、散逸モニタリング付き水晶振動子マイクロバランス(QCM-D)を用いたラベルフリー法 で モニターしました。PNPEのBMDCへの親和性の特性評価に続いて、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)を使用して抗原取り込みを決定しました。その結果、PNPEのBMDCに対する親和性が高く、抗原の効率的なインターナリゼーションが示されました。PNPEはAPCに対してより高い親和性を示し、抗原の内在化をよりよく刺激して免疫応答を増強する可能性があると予想しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は、抗原インターナリゼーションを強化するための送達システムとして、PLGAナノ粒子安定化油/水エマルジョンを開発しました。調製されたPNPEは、着弾点を支える高密度に充填された表面と、免疫細胞膜との強力な細胞接触のための独特の柔らかさおよび流動性を有していた。さらに、油/水界面はハイコンテント抗原ローディングを提供し、両親媒性PLGAは免疫細胞への抗原輸送に対し?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家重点研究開発プログラム(2021YFE020527、2021YFC2302605、2021YFC2300142)、中国科学院基礎フロンティア科学研究プログラム(ZDBS-LY-SLH040)の0から1のオリジナルイノベーションプロジェクト、中国国家自然科学財団の革新的研究グループ財団(助成金番号21821005)の支援を受けました。
Materials
| AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
| Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
| Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
| Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
| Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
| Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
| Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
| Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
| QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
| Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
| RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
| Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |
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