Antijen İçselleştirmesini Artırmak için Parçacık Stabilize Emülsiyonun Hücresel Afinitesi
Summary
Verimli adjuvanları rasyonel olarak tasarlamak için, poli-laktik-ko-glikolik asit nanopartikül-stabilize Pickering emülsiyonu (PNPE) geliştirdik. PNPE, güçlü hücresel temas için benzersiz yumuşaklığa ve hidrofobik bir arayüze sahipti ve yüksek içerikli antijen yüklemesi sundu, dağıtım sisteminin antijen sunan hücrelere hücresel afinitesini artırdı ve antijenlerin verimli bir şekilde içselleştirilmesini sağladı.
Abstract
Mikro-/nanopartiküllerin hücresel afinitesi, ilaç dağıtımı ve immün yanıt için gerekli olan hücresel tanıma, hücresel alım ve aktivasyonun ön koşuludur. Bu çalışma, katı parçacıkların yükünün, boyutunun ve şeklinin hücre afinitesi üzerindeki etkilerinin genellikle göz önünde bulundurulduğu gözleminden kaynaklanmıştır, ancak yumuşaklığın, dinamik yeniden yapılanma fenomeninin ve karmaşık arayüz etkileşiminin hücresel afinitedeki temel rolünü nadiren fark ediyoruz. Burada, katı formların eksikliklerinin üstesinden gelen ve patojenlerin esnekliğini ve akışkanlığını simüle eden poli-laktik-ko-glikolik asit (PLGA) nanopartikül stabilize Pickering emülsiyonu (PNPE) geliştirdik. PNPE’nin hücre yüzeylerine afinitesini test etmek ve bağışıklık hücreleri tarafından daha sonra içselleştirilmesini detaylandırmak için bir yöntem oluşturulmuştur. PNPE’nin biyo-mimetik hücre dışı veziküllere (bEV’ler) olan afinitesi – kemik iliği dendritik hücrelerinin (BMDC’ler) yerini alır – hücre emülsiyon yapışmasının gerçek zamanlı izlenmesine izin veren dağılım izlemeli (QCM-D) bir kuvars kristali mikro dengesi kullanılarak belirlendi. Daha sonra, PNPE antijeni (ovalbümin, OVA) vermek için kullanıldı ve BMDC’ler tarafından antijenlerin alımı konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanılarak gözlendi. Temsili sonuçlar, PNPE’nin bEV’lerle karşılaştığında frekansı (ΔF) hemen azalttığını ve PNPE’nin BMDC’lere hızlı yapışmasını ve yüksek afinitesini gösterdiğini gösterdi. PNPE, PLGA mikropartiküllerinden (PMP’ler) ve AddaVax adjuvanından (yüzey aktif madde stabilize nano-emülsiyon [SSE] olarak belirtilen) hücre zarına önemli ölçüde daha güçlü bağlanma gösterdi. Ayrıca, dinamik eğrilik değişiklikleri ve lateral difüzyonlar yoluyla immünositlere hücresel afinitenin artması nedeniyle, antijen alımı daha sonra PMP’ler ve SSE ile karşılaştırıldığında artmıştır. Bu protokol, yüksek hücre afinitesi ve etkili antijen içselleştirmesi ile yeni formülasyonlar tasarlamak için içgörüler sağlar ve etkili aşıların geliştirilmesi için bir platform sağlar.
Introduction
Epidemik, kronik ve bulaşıcı hastalıklarla mücadele etmek için, profilaktik ve terapötik aşılar için etkili adjuvanlar geliştirmek zorunludur 1,2. İdeal olarak, adjuvanlar mükemmel güvenlik ve immün aktivasyona sahip olmalıdır 3,4,5. Antijen sunan hücreler (APC’ler) tarafından antijenlerin etkin alımı ve işlenmesinin, aşağı akış sinyal kaskadlarında ve immün yanıtın başlatılmasında önemli bir aşama olduğu düşünülmektedir 6,7,8. Bu nedenle, bağışıklık hücrelerinin antijenlerle etkileşim mekanizmasını net bir şekilde anlamak ve içselleştirmeyi arttırmak için adjuvanlar tasarlamak, aşıların etkinliğini artırmak için etkili stratejilerdir.
Benzersiz özelliklere sahip mikro-/ nanopartiküller daha önce antijenlerin hücresel alımına ve patojenle ilişkili moleküler modellerle hücresel etkileşime aracılık etmek için antijen dağıtım sistemleri olarak araştırılmıştır 9,10. Hücrelerle temas ettikten sonra, dağıtım sistemleri hücre dışı matris ve hücre zarı ile etkileşime girmeye başlar, bu da içselleştirmeye ve ardından hücresel tepkilere yol açar11,12. Önceki çalışmalar, parçacıkların içselleştirilmesinin hücre zarı-parçacık yapışması13, ardından hücre zarının esnek deformasyonu ve reseptörün yüzey zarına difüzyonu14,15 yoluyla gerçekleştiğini ortaya koymuştur. Bu koşullar altında, dağıtım sisteminin özellikleri, APC’lere olan yakınlığa bağlıdır ve bu da daha sonra16,17 alım miktarını etkiler.
Gelişmiş bağışıklık tepkisi için dağıtım sisteminin tasarımı hakkında fikir edinmek için, parçacıkların özellikleri ile hücresel alım arasındaki ilişkinin araştırılmasına kapsamlı çabalar odaklanmıştır. Bu çalışma, çeşitli yüklere, boyutlara ve şekillere sahip katı mikro-/ nanopartiküllerin genellikle bu ışıkta incelendiği, akışkanlığın antijen içselleştirmedeki rolünün nadiren araştırıldığı gözleminden kaynaklanmıştır18,19. Aslında, yapışma sırasında, yumuşak parçacıklar, katı parçacıklar20,21 tarafından zorlukla çoğaltılabilen çok değerli etkileşimler için temas alanını arttırmak için dinamik eğrilik değişiklikleri ve yanal difüzyonlar gösterdi. Ek olarak, hücre zarları alım bölgesinde fosfolipid çift katmanlıdır (sfengolipidler veya kolesterol) ve hidrofobik maddeler lipitlerin konformasyonel entropisini değiştirebilir ve hücresel alım için gereken enerji miktarını azaltabilir22,23. Bu nedenle, hareketliliği arttırmak ve dağıtım sisteminin hidrofobikliğini teşvik etmek, bağışıklık tepkisini arttırmak için antijen içselleştirmesini güçlendirmek için etkili bir strateji olabilir.
İki karışmaz sıvı arasındaki arayüzde bir araya getirilen katı parçacıklar tarafından stabilize edilen Pickering emülsiyonu, biyolojik alanda yaygın olarak kullanılmaktadır24,25. Aslında, yağ / su arayüzündeki toplayıcı parçacıklar, çok seviyeli dağıtım sistemi-hücresel etkileşimleri teşvik eden çok seviyeli yapıların formülasyonunu belirler ve ilaç dağıtımında çok fonksiyonlu fizyokimyasal özellikleri daha da indükler. Deforme olmaları ve lateral hareketlilikleri nedeniyle, Pickering emülsiyonlarının immünositlerle çok değerli hücresel etkileşime girmesi ve membran proteinleri tarafından tanınması bekleniyordu26. Ek olarak, Pickering emülsiyonlarındaki yağlı misel çekirdekleri tamamen katı parçacıklarla kaplı olmadığından, Pickering emülsiyonları, yağ/su arayüzündeki parçacıklar arasında farklı boyutlarda boşluklara sahiptir ve bu da daha yüksek hidrofobikliğe neden olur. Bu nedenle, Pickering emülsiyonlarının APC’lere olan afinitesini araştırmak ve verimli adjuvanlar geliştirmek için sonraki içselleştirmeyi detaylandırmak çok önemlidir.
Bu düşüncelere dayanarak, PNPE’nin BMDC’lere ve hücresel içselleştirmeye olan yakınlığı konusunda değerli bilgiler edinmeye yardımcı olan bir akışkanlık aşısı dağıtım sistemi olarak PLGA nanopartikül stabilize Pickering emülsiyonunu (PNPE) tasarladık. Biyo-mimetik hücre dışı veziküllerin (bEV’ler; BMDC’lerin değiştirilmesi) PNPE’ye gerçek zamanlı yapışması, dağılım izlemeli (QCM-D) bir kuvars kristali mikro terazisi kullanılarak etiketsiz bir yöntemle izlendi . PNPE’nin BMDC’lere afinitesinin karakterizasyonunu takiben, antijen alımını belirlemek için konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanıldı. Sonuç, PNPE’nin BMDC’lere daha yüksek afinitesini ve antijenin verimli bir şekilde içselleştirilmesini göstermiştir. PNPE’nin APC’lere daha yüksek afinite göstereceğini ve bu da immün yanıtları arttırmak için antijenlerin içselleştirilmesini daha iyi uyarabileceğini tahmin ettik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gelişmiş antijen içselleştirme için bir dağıtım sistemi olarak PLGA nanopartikül stabilize yağ / su emülsiyonunu geliştirdik. Hazırlanan PNPE, iniş noktasını desteklemek için yoğun bir şekilde paketlenmiş bir yüzeye ve bağışıklık hücresi zarı ile güçlü hücresel temas için benzersiz yumuşaklık ve akışkanlığa sahipti. Ayrıca, yağ / su arayüzü yüksek içerikli antijen yüklemesi sundu ve amfifilik PLGA, antijenlerin bağışıklık hücrelerine taşınması için PNPE’ye yüksek s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), Çin Bilimler Akademisi Temel Sınır Bilimsel Araştırma Programı (ZDBS-LY-SLH040), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Yenilikçi Araştırma Grupları Vakfı (Hibe No. 21821005) tarafından desteklenen Proje tarafından desteklenmiştir.
Materials
| AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
| Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
| Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
| Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
| Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
| Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
| Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
| Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
| QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
| Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
| RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
| Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |
Referências
- Ma, G., Gu, Z., Wei, W. Advanced vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 183, 114170 (2022).
- Sharma, J., Carson, C. S., Douglas, T., Wilson, J. T., Joyce, S. Nano-particulate platforms for vaccine delivery to enhance antigen-specific cd8(+) t-cell response. Methods in Molecular Biology. 2412, 367-398 (2022).
- Nguyen, T. P., et al. Safety and immunogenicity of nanocovax, a sars-cov-2 recombinant spike protein vaccine: interim results of a double-blind, randomised controlled phase 1 and 2 trial. The Lancet Regional Health. Western Pacific. 24, 100474 (2022).
- Coates, E. E., et al. Safety and immunogenicity of a trivalent virus-like particle vaccine against western, eastern, and venezuelan equine encephalitis viruses: a phase 1, open-label, dose-escalation, randomised clinical trial. The Lancet Infectious Diseases. 22 (8), 1210-1220 (2022).
- Wei, L., et al. Efficacy and safety of a nanoparticle therapeutic vaccine in patients with chronic hepatitis b: a randomized clinical trial. Hepatology. 75 (1), 182-195 (2022).
- Krishnan, R., Kim, J. O., Qadiri, S. S. N., Kim, J. O., Oh, M. J. Early viral uptake and host-associated immune response in the tissues of seven-band grouper following a bath challenge with nervous necrosis virus. Fish & Shellfish Immunology. 103, 454-463 (2020).
- Mishra, D., Mishra, P. K., Dubey, V., Dabadghao, S., Jain, N. K. Evaluation of uptake and generation of immune response by murine dendritic cells pulsed with hepatitis b surface antigen-loaded elastic liposomes. Vaccine. 25 (39-40), 6939-6944 (2007).
- Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., Mccullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
- Jing, H., et al. Fluorescent artificial antigens revealed extended membrane networks utilized by live dendritic cells for antigen uptake. Nano Letters. 22 (10), 4020-4027 (2022).
- Meena, J., Goswami, D. G., Anish, C., Panda, A. K. Cellular uptake of polylactide particles induces size dependent cytoskeletal remodeling in antigen presenting cells. Biomaterials Science. 9 (23), 7962-7976 (2021).
- Yang, J., et al. Drug delivery via cell membrane fusion using lipopeptide modified liposomes. ACS Central Science. 2 (9), 621-630 (2016).
- Rawle, R., Kasson, P., Boxer, S. Disentangling viral membrane fusion from receptor binding by using synthetic dna-lipid conjugates totether influenza virus to model lipid membranes. Biophysical Journal. 111 (1), 123-131 (2016).
- Ha, H. K., Kim, J. W., Lee, M. R., Jun, W., Lee, W. J. Cellular uptake and cytotoxicity of β-lactoglobulin nanoparticles: the effects of particle size and surface charge. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 28 (3), 420-427 (2015).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Dankovich, T. M., et al. Extracellular matrix remodeling through endocytosis and resurfacing of tenascin-r. Nature Communications. 12 (1), 7129 (2021).
- Evans, E., Buxbaum, K. Affinity of red-blood-cell membrane for particle surfaces measured by the extent of particle encapsulation. Biophysical Journal. 34 (1), 1-12 (1981).
- Rohner, N. A., Purdue, L. N., Von Recum, H. A. Affinity-based polymers provide long-term immunotherapeutic drug delivery across particle size ranges optimal for macrophage targeting. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (4), 1693-1700 (2021).
- Zhou, X., Liu, Y., Wang, X. F., Li, X. M., Xiao, B. Effect of particle size on the cellular uptake and anti-inflammatory activity of oral nanotherapeutics. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 187, 110880 (2020).
- Zhang, D., et al. The morphology and surface charge-dependent cellular uptake efficiency of upconversion nanostructures revealed by single-particle optical microscopy. Chemical Science. 13 (12), 3610 (2022).
- Xi, Y. K., et al. Co2-responsive pickering emulsions stabilized by soft protein particles for interfacial biocatalysis. Chemical Science. 13 (10), 2884-2890 (2022).
- Trivedi, R. P., Klevets, I. I., Senyuk, B., Lee, T., Smalyukh, I. I. Reconfigurable interactions and three-dimensional patterning of colloidal particles and defects in lamellar soft media. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 109 (13), 4744-4749 (2012).
- De Araujo, A. D., Hoang, H. N., Lim, J., Mak, J. Y. W., Fairlie, D. P. Tuning electrostatic and hydrophobic surfaces of aromatic rings to enhance membrane association and cell uptake of peptides. Angewandte Chemie. 61 (29), 03995 (2022).
- Waku, T., et al. Effect of the hydrophilic-hydrophobic balance of antigen-loaded peptide nanofibers on their cellular uptake, cellular toxicity, and immune stimulatory properties. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3781 (2019).
- Meng, X., et al. A soft pickering emulsifier made from chitosan and peptides endows stimuli-responsiveness, bioactivity and biocompatibility to emulsion. Carbohydrate Polymers. 277, 118768 (2022).
- Wang, Z., et al. Fabrication and in vitro/vivo evaluation of drug nanocrystals self-stabilized pickering emulsion for oral delivery of quercetin. Pharmaceutics. 14 (5), 897 (2022).
- Ji, J., et al. Core-shell-structured silica/polyacrylate particles prepared by pickering emulsion: influence of the nucleation model on particle interfacial organization and emulsion stability. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 534 (2014).
- Chen, l., et al. Quantitative evaluation of proteins with bicinchoninic acid (bca): resonance raman and surface-enhanced resonance raman scattering-based methods. Analyst. 137 (24), 5834-5838 (2012).
- Colino, J., Shen, Y., Snapper, C. M. Dendritic cells pulsed with intact streptococcus pneumoniae elicit both protein- and polysaccharide-specific immunoglobulin isotype responses in vivo through distinct mechanisms. The Journal of Experimental Medicine. 195 (1), 1-13 (2002).
- Zhang, Y., Wu, J., Zhang, H., Wei, J., Wu, J. Extracellular vesicles-mimetic encapsulation improves oncolytic viro-immunotherapy in tumors with low coxsackie and adenovirus receptor. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 574007 (2020).
- Cappellano, G., Abreu, H., Casale, C., Dianzani, U., Chiocchetti, A. Nano-microparticle platforms in developing next-generation vaccines. Vaccines. 9 (6), 606 (2021).
- McClelland, R. D., Culp, T. N., Marchant, D. J. Imaging flow cytometry and confocal immunofluorescence microscopy of virus-host cell interactions. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 11, 749039 (2021).
- Konry, T., Sarkar, S., Sabhachandani, P., Cohen, N. Innovative tools and technology for analysis of single cells and cell-cell interaction. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 18 (1), 259-284 (2016).
- D’Aurelio, R., et al. A comparison of EIS and QCM nanoMIP-based sensors for morphine. Nanomaterials. 11 (12), 3360 (2021).
- Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
- Rydell, G. E., Dahlin, A. B., Hook, F., Larson, G. QCM-D studies of human norovirus VLPs binding to glycosphingolipids in supported lipid bilayers reveal strain-specific characteristics. Glycobiology. 19 (11), 1176-1184 (2009).
