Cellulær affinitet af partikelstabiliseret emulsion for at øge antigeninternalisering
Summary
For rationelt at designe effektive adjuvanser udviklede vi poly-mælkesyre-co-glykolsyre-nanopartikelstabiliseret Pickering-emulsion (PNPE). PNPE havde unik blødhed og en hydrofob grænseflade til potent cellulær kontakt og tilbød antigenbelastning med højt indhold, hvilket forbedrede leveringssystemets cellulære affinitet til antigenpræsenterende celler og inducerede effektiv internalisering af antigener.
Abstract
Den cellulære affinitet af mikro- / nanopartikler er forudsætningen for cellulær genkendelse, cellulær optagelse og aktivering, som er afgørende for lægemiddelafgivelse og immunrespons. Den nuværende undersøgelse stammer fra den observation, at virkningerne af ladning, størrelse og form af faste partikler på celleaffinitet normalt overvejes, men vi indser sjældent den væsentlige rolle, som blødhed, dynamisk omstruktureringsfænomen og kompleks grænsefladeinteraktion spiller i cellulær affinitet. Her udviklede vi poly-mælkesyre-co-glycolsyre (PLGA) nanopartikelstabiliseret Pickering-emulsion (PNPE), der overvandt manglerne ved stive former og simulerede patogenernes fleksibilitet og fluiditet. En metode blev oprettet for at teste affiniteten af PNPE til celleoverflader og uddybe den efterfølgende internalisering af immunceller. Finiteten af PNPE til bio-mimetiske ekstracellulære vesikler (bEV’er) – erstatningen for knoglemarvsdendritiske celler (BMDC’er) – blev bestemt ved hjælp af en kvartskrystalmikrobalance med spredningsovervågning (QCM-D), som muliggjorde realtidsovervågning af celleemulsionsadhæsion. Efterfølgende blev PNPE brugt til at levere antigenet (ovalbumin, OVA), og optagelsen af antigenerne af BMDC’er blev observeret ved anvendelse af konfokal laserscanningsmikroskop (CLSM). Repræsentative resultater viste, at PNPE straks reducerede frekvensen (ΔF), når den stødte på bEV’erne, hvilket indikerer hurtig vedhæftning og høj affinitet af PNPE til BMDC’erne. PNPE viste signifikant stærkere binding til cellemembranen end PLGA-mikropartikler (PMP’er) og AddaVax-adjuvans (betegnet som overfladeaktivt stabiliseret nanoemulsion [SSE]). På grund af den forbedrede cellulære affinitet til immunocytterne gennem dynamiske krumningsændringer og laterale diffusioner blev antigenoptagelsen efterfølgende øget sammenlignet med PMP’er og SSE. Denne protokol giver indsigt i design af nye formuleringer med høj celleaffinitet og effektiv antigeninternalisering, hvilket giver en platform for udvikling af effektive vacciner.
Introduction
For at bekæmpe epidemiske, kroniske og smitsomme sygdomme er det bydende nødvendigt at udvikle effektive adjuvanser til profylaktiske og terapeutiske vaccinationer 1,2. Ideelt set bør adjuvanserne have fremragende sikkerhed og immunaktivering 3,4,5. Effektiv optagelse og proces af antigener af antigenpræsenterende celler (APC’er) menes at være et væsentligt stadium i nedstrøms signalkaskader og initiering af immunresponset 6,7,8. Derfor er det effektive strategier til at forbedre effektiviteten af vacciner at få en klar forståelse af mekanismen for interaktion mellem immunceller og antigener og designe adjuvanser til at forbedre internaliseringen.
Mikro-/nanopartikler med unikke egenskaber er tidligere blevet undersøgt som antigenafgivelsessystemer til at formidle den cellulære optagelse af antigener og den cellulære interaktion med patogenassocierede molekylære mønstre 9,10. Ved kontakt med celler begynder leveringssystemer at interagere med den ekstracellulære matrix og cellemembran, hvilket førte til internalisering og efterfølgende cellulære reaktioner11,12. Tidligere undersøgelser har vist, at internalisering af partikler finder sted gennem cellemembran-partikeladhæsion13, efterfulgt af fleksibel deformation af cellemembranen og diffusion af receptoren til overflademembranen14,15. Under disse omstændigheder afhænger leveringssystemets egenskaber af tilhørsforholdet til APC, som efterfølgende påvirker optagelsesmængden16,17.
For at få indsigt i designet af leveringssystemet til forbedret immunrespons har omfattende bestræbelser været fokuseret på undersøgelsen af forholdet mellem partiklernes egenskaber og cellulær optagelse. Den foreliggende undersøgelse stammer fra den observation, at faste mikro-/nanopartikler med forskellige ladninger, størrelser og former ofte studeres i dette lys, mens fluiditetens rolle i antigeninternalisering sjældent undersøges18,19. Faktisk viste de bløde partikler under vedhæftning dynamiske krumningsændringer og laterale diffusioner for at øge kontaktområdet for multivalente interaktioner, som næppe kan replikeres af de faste partikler20,21. Derudover er cellemembraner phospholipid dobbeltlag (sphingolipider eller kolesterol) på optagelsesstedet, og hydrofobe stoffer kan ændre den konformationelle entropi af lipider, hvilket reducerer mængden af energi, der kræves til cellulær optagelse22,23. Således kan forstærkning af mobilitet og fremme af hydrofobicitet af leveringssystemet være en effektiv strategi til styrkelse af antigeninternalisering for at forbedre immunresponset.
Pickeringemulsion, stabiliseret af faste partikler samlet ved grænsefladen mellem to ublandbare væsker, er blevet anvendt i vid udstrækning i det biologiske felt24,25. Faktisk bestemmer de aggregerende partikler på olie/ vand-grænsefladen formuleringen af strukturer på flere niveauer, som fremmer multi-level leveringssystem-cellulære interaktioner og yderligere inducerer multifunktionelle fysiokemiske egenskaber i lægemiddelafgivelse. På grund af deres deformerbarhed og laterale mobilitet forventedes pickeringemulsioner at komme ind i multivalent cellulær interaktion med immunocytterne og blive genkendt af membranproteinerne26. Da olieholdige micellekerner i Pickering-emulsioner ikke er helt dækket af faste partikler, har Pickering-emulsioner desuden huller af forskellig størrelse mellem partikler på olie/vand-grænsefladen, hvilket forårsager højere hydrofobicitet. Det er således afgørende at undersøge affiniteten af Pickering-emulsioner til APC’er og uddybe den efterfølgende internalisering for at udvikle effektive adjuvanser.
Baseret på disse overvejelser konstruerede vi en PLGA nanopartikelstabiliseret Pickering-emulsion (PNPE) som et fluiditetsvaccineleveringssystem, der også hjalp med at få værdifuld indsigt i PNPE’s affinitet til BMDC’er og cellulær internalisering. Realtidsadhæsionen af bio-mimetiske ekstracellulære vesikler (bEV’er; en erstatning af BMDC’er) til PNPE blev overvåget via en etiketfri metode ved hjælp af en kvartskrystalmikrobalance med spredningsovervågning (QCM-D). Efter karakterisering af PNPE’s affinitet til BMDC’er blev konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) brugt til at bestemme antigenoptagelsen. Resultatet indikerede den højere affinitet af PNPE til BMDC’er og den effektive internalisering af antigenet. Vi forventede, at PNPE ville udvise højere affinitet til APC’er, hvilket bedre kan stimulere internaliseringen af antigener for at forbedre immunresponserne.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi udviklede PLGA nanopartikelstabiliseret olie/vandemulsion som et leveringssystem til forbedret antigeninternalisering. Den forberedte PNPE havde en tæt pakket overflade til at understøtte landingsstedet og unik blødhed og fluiditet for potent cellulær kontakt med immuncellemembranen. Desuden tilbød olie/vand-grænsefladen antigenbelastning med højt indhold, og amfifil PLGA gav PNPE høj stabilitet til transport af antigener til immunceller. PNPE kunne hurtigt klæbe til overfladen af cellerne, hvilket indikerer,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af projekt støttet af Kinas nationale nøgleforsknings- og udviklingsprogram (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), Fra 0 til 1 originalt innovationsprojekt af grundlæggende frontier videnskabeligt forskningsprogram for kinesisk videnskabsakademi (ZDBS-LY-SLH040), Stiftelsen for innovative forskningsgrupper fra National Natural Science Foundation of China (tilskud nr. 21821005).
Materials
| AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
| Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
| Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
| Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
| Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
| Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
| Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
| Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
| QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
| Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
| RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
| Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |
Referências
- Ma, G., Gu, Z., Wei, W. Advanced vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 183, 114170 (2022).
- Sharma, J., Carson, C. S., Douglas, T., Wilson, J. T., Joyce, S. Nano-particulate platforms for vaccine delivery to enhance antigen-specific cd8(+) t-cell response. Methods in Molecular Biology. 2412, 367-398 (2022).
- Nguyen, T. P., et al. Safety and immunogenicity of nanocovax, a sars-cov-2 recombinant spike protein vaccine: interim results of a double-blind, randomised controlled phase 1 and 2 trial. The Lancet Regional Health. Western Pacific. 24, 100474 (2022).
- Coates, E. E., et al. Safety and immunogenicity of a trivalent virus-like particle vaccine against western, eastern, and venezuelan equine encephalitis viruses: a phase 1, open-label, dose-escalation, randomised clinical trial. The Lancet Infectious Diseases. 22 (8), 1210-1220 (2022).
- Wei, L., et al. Efficacy and safety of a nanoparticle therapeutic vaccine in patients with chronic hepatitis b: a randomized clinical trial. Hepatology. 75 (1), 182-195 (2022).
- Krishnan, R., Kim, J. O., Qadiri, S. S. N., Kim, J. O., Oh, M. J. Early viral uptake and host-associated immune response in the tissues of seven-band grouper following a bath challenge with nervous necrosis virus. Fish & Shellfish Immunology. 103, 454-463 (2020).
- Mishra, D., Mishra, P. K., Dubey, V., Dabadghao, S., Jain, N. K. Evaluation of uptake and generation of immune response by murine dendritic cells pulsed with hepatitis b surface antigen-loaded elastic liposomes. Vaccine. 25 (39-40), 6939-6944 (2007).
- Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., Mccullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
- Jing, H., et al. Fluorescent artificial antigens revealed extended membrane networks utilized by live dendritic cells for antigen uptake. Nano Letters. 22 (10), 4020-4027 (2022).
- Meena, J., Goswami, D. G., Anish, C., Panda, A. K. Cellular uptake of polylactide particles induces size dependent cytoskeletal remodeling in antigen presenting cells. Biomaterials Science. 9 (23), 7962-7976 (2021).
- Yang, J., et al. Drug delivery via cell membrane fusion using lipopeptide modified liposomes. ACS Central Science. 2 (9), 621-630 (2016).
- Rawle, R., Kasson, P., Boxer, S. Disentangling viral membrane fusion from receptor binding by using synthetic dna-lipid conjugates totether influenza virus to model lipid membranes. Biophysical Journal. 111 (1), 123-131 (2016).
- Ha, H. K., Kim, J. W., Lee, M. R., Jun, W., Lee, W. J. Cellular uptake and cytotoxicity of β-lactoglobulin nanoparticles: the effects of particle size and surface charge. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 28 (3), 420-427 (2015).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Dankovich, T. M., et al. Extracellular matrix remodeling through endocytosis and resurfacing of tenascin-r. Nature Communications. 12 (1), 7129 (2021).
- Evans, E., Buxbaum, K. Affinity of red-blood-cell membrane for particle surfaces measured by the extent of particle encapsulation. Biophysical Journal. 34 (1), 1-12 (1981).
- Rohner, N. A., Purdue, L. N., Von Recum, H. A. Affinity-based polymers provide long-term immunotherapeutic drug delivery across particle size ranges optimal for macrophage targeting. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (4), 1693-1700 (2021).
- Zhou, X., Liu, Y., Wang, X. F., Li, X. M., Xiao, B. Effect of particle size on the cellular uptake and anti-inflammatory activity of oral nanotherapeutics. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 187, 110880 (2020).
- Zhang, D., et al. The morphology and surface charge-dependent cellular uptake efficiency of upconversion nanostructures revealed by single-particle optical microscopy. Chemical Science. 13 (12), 3610 (2022).
- Xi, Y. K., et al. Co2-responsive pickering emulsions stabilized by soft protein particles for interfacial biocatalysis. Chemical Science. 13 (10), 2884-2890 (2022).
- Trivedi, R. P., Klevets, I. I., Senyuk, B., Lee, T., Smalyukh, I. I. Reconfigurable interactions and three-dimensional patterning of colloidal particles and defects in lamellar soft media. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 109 (13), 4744-4749 (2012).
- De Araujo, A. D., Hoang, H. N., Lim, J., Mak, J. Y. W., Fairlie, D. P. Tuning electrostatic and hydrophobic surfaces of aromatic rings to enhance membrane association and cell uptake of peptides. Angewandte Chemie. 61 (29), 03995 (2022).
- Waku, T., et al. Effect of the hydrophilic-hydrophobic balance of antigen-loaded peptide nanofibers on their cellular uptake, cellular toxicity, and immune stimulatory properties. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3781 (2019).
- Meng, X., et al. A soft pickering emulsifier made from chitosan and peptides endows stimuli-responsiveness, bioactivity and biocompatibility to emulsion. Carbohydrate Polymers. 277, 118768 (2022).
- Wang, Z., et al. Fabrication and in vitro/vivo evaluation of drug nanocrystals self-stabilized pickering emulsion for oral delivery of quercetin. Pharmaceutics. 14 (5), 897 (2022).
- Ji, J., et al. Core-shell-structured silica/polyacrylate particles prepared by pickering emulsion: influence of the nucleation model on particle interfacial organization and emulsion stability. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 534 (2014).
- Chen, l., et al. Quantitative evaluation of proteins with bicinchoninic acid (bca): resonance raman and surface-enhanced resonance raman scattering-based methods. Analyst. 137 (24), 5834-5838 (2012).
- Colino, J., Shen, Y., Snapper, C. M. Dendritic cells pulsed with intact streptococcus pneumoniae elicit both protein- and polysaccharide-specific immunoglobulin isotype responses in vivo through distinct mechanisms. The Journal of Experimental Medicine. 195 (1), 1-13 (2002).
- Zhang, Y., Wu, J., Zhang, H., Wei, J., Wu, J. Extracellular vesicles-mimetic encapsulation improves oncolytic viro-immunotherapy in tumors with low coxsackie and adenovirus receptor. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 574007 (2020).
- Cappellano, G., Abreu, H., Casale, C., Dianzani, U., Chiocchetti, A. Nano-microparticle platforms in developing next-generation vaccines. Vaccines. 9 (6), 606 (2021).
- McClelland, R. D., Culp, T. N., Marchant, D. J. Imaging flow cytometry and confocal immunofluorescence microscopy of virus-host cell interactions. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 11, 749039 (2021).
- Konry, T., Sarkar, S., Sabhachandani, P., Cohen, N. Innovative tools and technology for analysis of single cells and cell-cell interaction. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 18 (1), 259-284 (2016).
- D’Aurelio, R., et al. A comparison of EIS and QCM nanoMIP-based sensors for morphine. Nanomaterials. 11 (12), 3360 (2021).
- Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
- Rydell, G. E., Dahlin, A. B., Hook, F., Larson, G. QCM-D studies of human norovirus VLPs binding to glycosphingolipids in supported lipid bilayers reveal strain-specific characteristics. Glycobiology. 19 (11), 1176-1184 (2009).
