Manipulación genética mediada por fagos de la enfermedad de Lyme Espiroqueta Borrelia burgdorferi
Summary
La capacidad de los bacteriófagos para mover el ADN entre las células bacterianas los convierte en herramientas efectivas para la manipulación genética de sus huéspedes bacterianos. Aquí se presenta una metodología para inducir, recuperar y usar φBB-1, un bacteriófago de Borrelia burgdorferi, para transducir ADN heterólogo entre diferentes cepas de la espiroqueta de la enfermedad de Lyme.
Abstract
La introducción de ADN extraño en la espiroqueta Borrelia burgdorferi se ha logrado casi exclusivamente mediante la transformación mediante electroporación. Este proceso tiene eficiencias notablemente más bajas en la espiroqueta de la enfermedad de Lyme en relación con otras bacterias Gram-negativas mejor caracterizadas. La tasa de éxito de la transformación depende en gran medida de tener cantidades concentradas de ADN de alta calidad de antecedentes específicos y está sujeta a una variabilidad significativa de cepa a cepa. Los medios alternativos para introducir ADN extraño (es decir, vectores lanzadera, reporteros fluorescentes y marcadores de resistencia a los antibióticos) en B. burgdorferi podrían ser una adición importante al arsenal de herramientas útiles para la manipulación genética de la espiroqueta de la enfermedad de Lyme. Los bacteriófagos han sido bien reconocidos como mecanismos naturales para el movimiento del ADN entre las bacterias en un proceso llamado transducción. En este estudio, se ha desarrollado un método para utilizar el ubicuo fago borrelial φBB-1 para transducir ADN entre células de B. burgdorferi de los mismos y diferentes antecedentes genéticos. El ADN transducido incluye tanto ADN borrelial como ADN heterólogo en forma de pequeños vectores lanzadera. Esta demostración sugiere un uso potencial de la transducción mediada por fagos como complemento de la electroporación para la manipulación genética de la espiroqueta de la enfermedad de Lyme. Este informe describe métodos para la inducción y purificación del fago φBB-1 de B. burgdorferi, el uso de este fago en ensayos de transducción y la selección y selección de transductores potenciales.
Introduction
El desarrollo de herramientas para la manipulación genética de la bacteria espiroqueta Borrelia burgdorferi ha añadido un valor inconmensurable a la comprensión de la naturaleza de la enfermedad de Lyme 1,2,3,4. B. burgdorferi tiene un genoma inusualmente complejo compuesto por un pequeño cromosoma lineal y plásmidos lineales y circulares 5,6. La pérdida espontánea de plásmidos, el reordenamiento intragénico (movimiento de genes de un plásmido a otro dentro del mismo organismo) y la transferencia horizontal de genes (HGT, el movimiento de ADN entre dos organismos) han dado lugar a una cantidad vertiginosa de heterogeneidad genética entre B. burgdorferi (para un ejemplo, ver Schutzer et al.7). Los genotipos resultantes (o “cepas”) son todos miembros de la misma especie, pero tienen diferencias genéticas que influyen en su capacidad para transmitir e infectar a diferentes huéspedes mamíferos 8,9,10,11. En este informe, el término “cepa” se utilizará para referirse a B. burgdorferi con un fondo genético particular de origen natural; El término “clon” se utilizará para referirse a una cepa que ha sido modificada genéticamente para un propósito particular o como resultado de una manipulación experimental.
La caja de herramientas moleculares disponible para su uso en B. burgdorferi incluye marcadores seleccionables, reporteros de genes, vectores lanzadera, mutagénesis de transposones, promotores inducibles y marcadores contraseleccionables (para una revisión, ver Drektrah y Samuels12). El uso efectivo de estas metodologías requiere la introducción artificial de ADN heterólogo (extraño) en una cepa de B. burgdorferi de interés. En B. burgdorferi, la introducción de ADN heterólogo se logra casi exclusivamente a través de la electroporación, un método que utiliza un pulso de electricidad para hacer una membrana bacteriana transitoriamente permeable a pequeños trozos de ADN introducidos en el medio1. La mayoría de las células (estimadas en ≥99,5%) son destruidas por el pulso, pero las células restantes tienen una alta frecuencia de retención del ADN heterólogo13. Aunque se considera uno de los métodos más eficientes para introducir ADN en bacterias, la frecuencia de electroporación en B. burgdorferi es muy baja (oscilando entre 1 transformador en 5 × 104 a 5 × 106 células)13. Las barreras para lograr frecuencias más altas de transformación parecen ser tanto técnicas como biológicas. Las barreras técnicas para el éxito de la electroporación de B. burgdorferi incluyen tanto la cantidad de ADN (>10 μg) que es necesaria como el requisito de que las espiroquetas estén exactamente en la fase de crecimiento correcta (mid-log, entre 2 × 107 células·mL−1 y 7 × 107 células·mL−1) al preparar células electrocompetentes12,13. Estas barreras técnicas, sin embargo, pueden ser más fáciles de superar que las barreras biológicas.
Los investigadores de la enfermedad de Lyme reconocen que los clones de B. burgdorferi se pueden dividir en dos grandes categorías con respecto a su capacidad para ser manipulados genéticamente13,14. Los aislados de alto paso, adaptados al laboratorio, a menudo se transforman fácilmente, pero generalmente han perdido los plásmidos esenciales para la infectividad, se comportan de manera fisiológicamente aberrante y no pueden infectar a un huésped mamífero o persistir dentro de un vector de garrapatas12,13. Si bien estos clones han sido útiles para diseccionar la biología molecular de la espiroqueta dentro del laboratorio, son de poco valor para estudiar la espiroqueta dentro del contexto biológico del ciclo enzoótico. Los aislados infecciosos de paso bajo, por otro lado, se comportan de manera fisiológica que refleja un estado infeccioso y pueden completar el ciclo infeccioso, pero generalmente son recalcitrantes a la introducción de ADN heterólogo y, por lo tanto, son difíciles de manipular para el estudio12,13. La dificultad para transformar aislados de paso bajo está relacionada con al menos dos factores diferentes: (i) los aislados de paso bajo a menudo se agrupan estrechamente, particularmente en las condiciones de alta densidad requeridas para la electroporación, bloqueando así muchas células de la aplicación completa de la carga eléctrica o el acceso al ADN en el medio13,15; y (ii) B. burgdorferi codifica al menos dos sistemas diferentes de modificación de restricción transmitida por plásmidos (R-M) que pueden perderse en aislados de paso alto14,16. Los sistemas R-M han evolucionado para permitir que las bacterias reconozcan y eliminen el ADN extraño17. De hecho, varios estudios en B. burgdorferi han demostrado que las eficiencias de transformación aumentan cuando la fuente del ADN es B. burgdorferi en lugar de Escherichia coli13,16. Desafortunadamente, adquirir la alta concentración requerida de ADN para la electroporación de B. burgdorferi es una perspectiva costosa y lenta. Otra preocupación potencial al electroporar y seleccionar aislados de paso bajo es que el proceso parece favorecer a los transformadores que han perdido el plásmido crítico asociado a virulencia, lp2514,18,19; por lo tanto, el acto mismo de manipular genéticamente aislados de B. burgdorferi de paso bajo mediante electroporación puede seleccionar clones que no son adecuados para el análisis biológicamente relevante dentro del ciclo enzoótico20. Dados estos problemas, un sistema en el que el ADN heterólogo podría electrotransformarse en clones de B. burgdorferi de alto paso y luego transferirse a aislados infecciosos de paso bajo por un método distinto de la electroporación podría ser una adición bienvenida a la creciente colección de herramientas moleculares disponibles para su uso en la espiroqueta de la enfermedad de Lyme.
Además de la transformación (la captación de ADN desnudo), hay otros dos mecanismos por los cuales las bacterias toman regularmente ADN heterólogo: la conjugación, que es el intercambio de ADN entre bacterias en contacto físico directo entre sí, y la transducción, que es el intercambio de ADN mediado por un bacteriófago21. De hecho, la capacidad del bacteriófago para mediar HGT ha sido utilizada como una herramienta experimental para diseccionar los procesos moleculares dentro de varios sistemas bacterianos22,23,24. B. burgdorferi no es naturalmente competente para la absorción de ADN desnudo, y hay poca evidencia de que B. burgdorferi codifique el aparato necesario para promover una conjugación exitosa. Informes anteriores han descrito, sin embargo, la identificación y caracterización preliminar de φBB-1, un bacteriófago templado de B. burgdorferi25,26,27,28. φBB-1 empaqueta una familia de plásmidos de 30 kb encontrados dentro de B. burgdorferi25; Los miembros de esta familia han sido designados CP32. Consistente con un papel para φBB-1 en la participación en HGT entre cepas de B. burgdorferi, Stevenson et al. informaron un cp32 idéntico encontrado en dos cepas con cp32s dispares, lo que sugiere un intercambio reciente de esta cp32 entre estas dos cepas, probablemente a través de la transducción29. También hay evidencia de una recombinación significativa a través de HGT entre los cp32 en un genoma relativamente estable30,31,32,33. Finalmente, la capacidad de φBB-1 para transducir tanto cp32s como ADN vector lanzadera heterólogo entre células de la misma cepa y entre células de dos cepas diferentes ha sido demostrada previamente27,28. Dados estos hallazgos, φBB-1 se ha propuesto como otra herramienta a desarrollar para la disección de la biología molecular de B. burgdorferi.
El objetivo de este informe es detallar un método para inducir y purificar el fago φBB-1 de B. burgdorferi, así como proporcionar un protocolo para realizar un ensayo de transducción entre clones de B. burgdorferi y seleccionar y seleccionar posibles transductores.
Protocol
Representative Results
Discussion
El uso de la transducción podría representar un método para superar al menos algunas de las barreras biológicas y técnicas asociadas con la electrotransformación de B. burgdorferi 1,4,13,37. En muchos sistemas, el bacteriófago puede mover el ADN del huésped (no profago) entre las células bacterianas mediante transducción generalizada o especializada 22,23,24,49,50.<sup class=…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El autor desea agradecer a Shawna Reed, D. Scott Samuels y Patrick Secor por su útil discusión y a Vareeon (Pam) Chonweerawong por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Ciencias Biomédicas y becas de investigación de la facultad a Christian H. Eggers de la Escuela de Ciencias de la Salud de la Universidad de Quinnipiac.
Materials
| 1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size) | Millipore Sigma | S2GPU10RE | |
| 12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene) | USA Scientific | 1450-0810 | holds 4 mL with low void volume (for induction) |
| 15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) | USA Scientific | 5618-8271 | |
| 1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG) | Millipore Sigma | CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute | |
| 5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile) | Thermo Fisher Scientific | 13-678-8A | autoclave prior to use |
| 50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) | USA Scientific | 1500-1211 | |
| Absolute ethanol | |||
| Agarose LE | Dot Scientific inc. | AGLE-500 | |
| Bacto Neopeptone | Gibco | DF0119-17-9 | |
| Bacto TC Yeastolate | Gibco | 255772 | |
| Bovine serum albumin (serum replacement grade) | Gemini Bio-Products | 700-104P | |
| Chloroform (for molecular biology) | Thermo Fisher Scientific | BP1145-1 | CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood |
| CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder) | US Biological | C5900-01 | cell culture grade |
| Erythromycin | Research Products International Corp | E57000-25.0 | |
| Gentamicin reagent solution | Gibco | 15750-060 | |
| Glucose (Dextrose Anhydrous) | Thermo Fisher Scientific | BP350-500 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Kanamycin sulfate | Thermo Fisher Scientific | 25389-94-0 | |
| Millex-GS (0.22 µM pore size) | Millipore Sigma | SLGSM33SS | to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions |
| Mitomycin C | Thermo Fisher Scientific | BP25312 | CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood |
| N-acetyl-D-glucosamine | MP Biomedicals, LLC | 100068 | |
| Oligonucleotides (primers for PCR) | IDT DNA | ||
| OmniPrep (total genomic extraction kit) | G Biosciences | 786-136 | |
| Petri Dish (100 mm × 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser scientific | HS-3900 | |
| Petroff-Hausser counting chamber cover glass | Hausser scientific | HS-5051 | |
| Polyethylene glycol 8000 (PEG) | Thermo Fisher Scientific | BP233-1 | |
| Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS) | Pel-Freez Biologicals | 31119-3 | heat inactivate as per manufacturer's instructions |
| Semi-micro UV transparent cuvettes | USA Scientific | 9750-9150 | |
| Sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium pyruvate | Millipore Sigma | P8674-25G | |
| Spectronic Genesys 5 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Streptomycin sulfate solution | Millipore Sigma | S6501-50G | |
| Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804-500G | sodium citrate for BSK |
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