A capacidade dos bacteriófagos de mover o DNA entre as células bacterianas os torna ferramentas eficazes para a manipulação genética de seus hospedeiros bacterianos. Apresenta-se aqui uma metodologia para induzir, recuperar e utilizar φBB-1, um bacteriófago de Borrelia burgdorferi, para transduzir DNA heterólogo entre diferentes cepas da espiroqueta da doença de Lyme.
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Artigo de método
Manipulação Genética Mediada por Fagos da Espiroqueta da Doença de Lyme Borrelia burgdorferi
Neste artigo
Resumo
Resumo
A introdução de DNA estranho na espiroqueta Borrelia burgdorferi foi quase exclusivamente realizada por transformação usando eletroporação. Este processo tem eficiências notavelmente mais baixas na espiroqueta da doença de Lyme em relação a outras bactérias Gram-negativas melhor caracterizadas. A taxa de sucesso da transformação é altamente dependente de ter concentrado quantidades de DNA de alta qualidade de origens específicas e está sujeita a uma variabilidade significativa de cepa para cepa. Meios alternativos para a introdução de DNA estranho (ou seja, vetores de transporte, repórteres fluorescentes e marcadores de resistência a antibióticos) em B. burgdorferi poderiam ser uma adição importante ao arsenal de ferramentas úteis para a manipulação genética da espiroqueta da doença de Lyme. Os bacteriófagos têm sido bem reconhecidos como mecanismos naturais para o movimento do DNA entre bactérias em um processo chamado transdução. Neste estudo, um método foi desenvolvido para usar o onipresente fago borrelial φBB-1 para transduzir DNA entre células de B. burgdorferi de origens genéticas iguais e diferentes. O DNA transduzido inclui DNA borrelial e DNA heterólogo na forma de pequenos vetores de transporte. Esta demonstração sugere um uso potencial de transdução mediada por fagos como complemento à eletroporação para a manipulação genética da espiroqueta da doença de Lyme. Este relato descreve métodos para a indução e purificação do fago φBB-1 de B. burgdorferi, o uso deste fago em ensaios de transdução e a seleção e triagem de potenciais transdutores.
Introdução
O desenvolvimento de ferramentas para a manipulação genética da bactéria espiroqueta Borrelia burgdorferi tem acrescentado um valor imensurável à compreensão da natureza da doença de Lyme 1,2,3,4. B. burgdorferi tem um genoma extraordinariamente complexo, composto por um pequeno cromossomo linear e plasmídeos lineares e circulares 5,6. A perda espontânea de plasmídeos, o rearranjo intragênico (movimento de genes de um plasmídeo para outro dentro do mesmo organismo) ....
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Protocolo
Todos os experimentos usando DNA recombinante e organismos BSL-2 foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Biossegurança da Universidade de Quinnipiac.
1. Preparação da cultura de B. burgdorferi para a produção de φBB-1
- Preparar o meio Barbour-Stoenner-Kelly suplementado com soro de coelho normal (BSK) inativado pelo calor a 6,6%15. Para 1 L de 1x BSK, combinar os componentes listados na Tabela 1 em 900 mL de água, ajustar o pH para 7,6 usando hidróxido de sódio 1 N e misturar lentamente a 4 °C por 2-4 h. Após a conclusão da mistura, verifique e reaj....
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Resultados
O uso de bacteriófagos para mover o DNA entre cepas de B. burgdorferi mais facilmente transformáveis ou clones que são recalcitrantes à eletrotransformação representa outra ferramenta para a investigação molecular contínua dos determinantes da doença de Lyme. O ensaio de transdução aqui descrito pode ser modificado conforme necessário para facilitar o movimento do DNA entre quaisquer clones de interesse usando um ou dois antibióticos para a seleção de transdutores potenciais. A transdução do DNA do prófago e dos.......
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Discussão
O uso da transdução poderia representar um método de superação de pelo menos algumas das barreiras biológicas e técnicas associadas à eletrotransformação de B. burgdorferi 1,4,13,37. Em muitos sistemas, o bacteriófago pode mover o DNA do hospedeiro (não prófago) entre células bacterianas por transdução generalizada ou especializada 22,23,24,49,50.
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Divulgações
O autor não tem nada a revelar.
Agradecimentos
O autor deseja agradecer a Shawna Reed, D. Scott Samuels e Patrick Secor por sua discussão útil e Vareeon (Pam) Chonweerawong por sua assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Ciências Biomédicas e bolsas de pesquisa do corpo docente para Christian H. Eggers da Escola de Ciências da Saúde da Universidade de Quinnipiac.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Unidades de filtro de 1 L (PES, 0,22 e micro; tamanho do poro m) | Millipore Sigma | S2GPU10RE | |
| tubo de 12 mm x 75 mm (tampa de posição dupla) (polipropileno) | USA Scientific | 1450-0810 | comporta 4 mL com baixo volume de vazios (para indução) |
| Tubos de centrífuga cônicos de 15 mL (polipropileno) | USA Scientific | 5618-8271 | |
| 1-metil-3-nitroso-nitroguanidina (MNNG) | Millipore Sigma | CUIDADO: potencial cancerígeno; não estão mais disponíveis, não testaram pipetas Pasteur substitutas de | |
| 5,75" (plugadas com algodão/vidro borossilicato/não estéreis) | Autoclave Thermo Fisher Scientific | 13-678-8A | antes de usar |
| tubos de centrífuga cônicos de 50 mL (polipropileno) | USA Scientific | 1500-1211 | |
| Etanol | |||
| Agarose LE | Dot Scientific inc. | AGLE-500 | |
| Bacto Neopeptona | Gibco | DF0119-17-9 | |
| Bacto TC Leveduralada | Gibco | 255772 | |
| Albumina de soro bovino (grau de reposição de soro) | Gemini Bio-Products | 700-104P | |
| Clorofórmio (para biologia molecular) | Thermo Fisher Scientific | BP1145-1 | CUIDADO: orgânico volátil; use apenas em uma capela de exaustão química |
| CMRL-1066 sem L-Glutamina (pó) | US Biological | C5900-01 | grau de cultura de células |
| Eritromicina | Research Products International Corp | E57000-25.0 | |
| Solução de reagente de gentamicina | Gibco | 15750-060 | |
| Glicose (dextrose anidra) | Thermo Fisher Scientific | BP350-500 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Sulfato de canamicina | Thermo Fisher Scientific | 25389-94-0 | |
| Millex-GS (0.22 µ Tamanho dos poros M) | Millipore Sigma | SLGSM33SS | para filtrar esterilizar antibióticos e outras soluções de pequeno volume |
| Mitomicina C | Thermo Fisher Scientific | BP25312 | CUIDADO: potencial cancerígeno; use apenas em um exaustor químico |
| N-acetil-D-glucosamina | MP Biomedicals, LLC | 100068 | |
| Oligonucleotídeos (primers para PCR) | IDT DNA | ||
| OmniPrep (kit de extração genômica total) | G Biosciences | 786-136 | |
| Placa de Petri (100 mm e 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Petroff-Hausser | Hausser scientific | HS-3900 | |
| Vidro de cobertura da câmara de contagem Petroff-Hausser | Hausser scientific | HS-5051 | |
| Polietilenoglicol 8000 (PEG) | Thermo Fisher Scientific | BP233-1 | |
| Soro de coelho não estéril traço-hemolisado jovem (NRS) | Pel-Freez Biologicals | 31119-3 | inativa o calor conforme as instruções do fabricante |
| Cuvetes semi-micro UV transparentes | USA Scientific | 9750-9150 | |
| Bicarbonato de sódio | Thermo Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Cloreto | de sódioThermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Piruvato de sódio | Millipore Sigma | P8674-25G | |
| Spectronic Genesys 5 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Citrato de sódio di-hidratado | Millipore Sigma | S1804-500G | Citrato de sódio para BSK |
Referências
- Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
- Winslow, C., Coburn, J. Recent discoveries and advancements in research on the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorf....
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Reimpressões e permissões
