Summary
Dette papir præsenterer en protokol for okulær mikrodissektion hos gnavere. Processen involverer enukleation af øjeæblet sammen med niktiteringsmembranen (dvs. det tredje øjenlåg). Dette efterfølges derefter af adskillelsen af de bageste og forreste øjenkopper.
Abstract
Den okulære mikrodissektion af gnaverøjet involverer segmenteringen af det enukleerede øjeæble med den vedhæftede niktiterende membran eller tredje øjenlåg for at opnå de forreste og bageste øjenkopper. Med denne teknik kan underdelene af øjet, herunder hornhindevæv, neuralt væv, retinal pigmentepitel (RPE) væv og linse, opnås til helmonteringer, kryosektionering og / eller enkeltcellesuspensioner af et specifikt okulært væv. Tilstedeværelsen af det tredje øjenlåg giver unikke og betydelige fordele, da det gavner vedligeholdelsen af øjets orientering, hvilket er vigtigt for forståelsen af øjenfysiologi efter enhver lokaliseret intervention eller i undersøgelser, der involverer okulær analyse vedrørende øjets rumlige topografi.
I denne metode enucleerede vi øjeæblet ved soklen sammen med det tredje øjenlåg ved forsigtigt og langsomt at skære gennem de ekstraokulære muskler og skære synsnerven. Øjeæblet blev gennemboret gennem hornhinden limbus ved hjælp af et mikroblad. Snittet blev brugt som indgangspunkt, hvilket gjorde det muligt at skære langs hornhinde-scleral-krydset ved at indsætte mikrosaks gennem snitpunktet. Små og kontinuerlige snit langs omkredsen blev lavet, indtil kopperne adskiltes. Disse kunne yderligere dissekeres ved forsigtigt at skrælle det gennemskinnelige lag af nethinden ved hjælp af Colibri suturerende tang for at opnå de neurale nethinden og RPE lag. Endvidere blev der foretaget tre/fire lige store snit fra periferien vinkelret på synscentret, indtil synsnerven blev nået. Dette åbnede de halvkugleformede kopper i en blomsterform, så de faldt fladt og let kunne monteres. Denne teknik er blevet brugt i vores laboratorium til hornhinde helmounts og retinale sektioner. Tilstedeværelsen af det tredje øjenlåg afgrænser den nasal-temporale orientering, som muliggør undersøgelse af forskellige celleterapiinterventioner efter transplantation og dermed den målrettede fysiologiske validering, der er afgørende for visualisering og nøjagtig repræsentation i sådanne undersøgelser.
Introduction
Okulær dissektion er en vigtig teknik i oftalmisk forskning og har gjort det muligt for efterforskere at få adgang til segmenterne af øjet til målrettede undersøgelser. Tidligere stolede okulære forskere på det okulære væv fra syge individer til deres studier. Imidlertid har det gradvist voksende antal stammer af oftalmiske gnavermodeller1 gennem årene mindsket behovet for humant okulært væv. Disse musestammer har muliggjort en dybere forståelse af okulær sygdom og interventioner. Men de har også skabt et behov for innovative teknikker til okulær mikrodissektion. Den lille størrelse og det begrænsede operationsområde begrænser i alvorlig grad den effektive adgang til de okulære underdele. På grund af den homogene cellulære samling af de bageste og forreste øjenkopper er det desuden vanskeligt at gennemføre målrettede interventioner efter dissektion. De nuværende mikrodissektionsteknikker for laser2 og kirurgisk mikrodissektion 3,4 er utilstrækkelige til at opfylde sådanne krav til okulær forskning. Lasermikrodissektion er meget effektiv i enkeltcelleanalyse, men det specifikke væv skal mikrodissekeres inden laserproceduren2. Teknikken kan isolere små områder af interesse fra et præ-dissekeret væv til molekylær analyse. Teknikken er således ikke egnet til fremstilling af helmonteringer eller til isolering af aksialt pakkede okulære lag for optimal visualisering.
Den kirurgiske metode er den mest anvendte teknik; Denne metode indebærer immobilisering af øjet via synsnerven5 og derefter udførelse af dissektionen. Denne praksis er vanskelig og kan beskadige ethvert skrøbeligt væv, da det sfæriske øje fortsætter med at bevæge sig under dissektion. På trods af at det er gavnligt for at isolere de forskellige sektioner af retinalagene, kan teknikken ikke afgrænse vævets rumlige orientering ved dissektion.
Under dissektion giver opretholdelse af tilstedeværelsen af den vedhæftede niktiterende membran eller det tredje øjenlåg (figur 1) unikke og betydelige fordele. I denne metode er øjet først enukleeret med det tredje øjenlåg. Derefter bruges det tredje øjenlåg til at immobilisere øjet6 (figur 2A). Dette efterfølges af gennemboring af øjeæblet gennem hornhindens limbus og brug af snittet som indgangspunkt (figur 2B, C). Derefter adskilles øjenkopperne ved at skære langs omkredsen anteriort og posteriort (figur 2D-G). Ved at dissekere den bageste øjenkop yderligere kan det gennemskinnelige lag af nethinden identificeres og forsigtigt skrælles af. Tre eller fire lige store snit foretages derefter i de opnåede halvkugleformede forreste og bageste kopper, som gør det muligt for disse blomsterformede kopper at falde fladt ned på et dias (figur 2H).
Det tredje øjenlåg hjælper med nem og effektiv håndtering under dissektionen, hvilket sikrer minimal skade på vævet, mens du får adgang til de forskellige okulære lag, og når der produceres helemonteringer. Endvidere hjælper tilstedeværelsen af det tredje øjenlåg med at lokalisere og undersøge lokaliserede interventioner under visualisering.
Proceduren i vores laboratorium er blevet udført på en CBA / J eller en rd1 musestamme ved P28 af ethvert køn. Proceduren kan udføres på enhver stamme, alder eller køn af dyr og har ingen bias i henhold til disse egenskaber.
Dyrene blev indkøbt fra kommercielle kilder (se materialetabel) og vedligeholdt på Small Animal Facility (SAF) ved National Institute of Immunology (NII). De blev holdt i individuelle ventilerede bure (IVC) og fik ad libitum adgang til forsuret autoklaveret vand og mad. De blev opretholdt ved 21-23 °C og med en 14 timers/10 timers lys/mørkecyklus.
Nedenfor er en modificeret kirurgisk metode til mikrodissektion af et museøje.
Protocol
Representative Results
Discussion
Okulær mikrodissektion har vist sig at være en vanskelig opgave på grund af gnaverøjets lille størrelse og sfæriske form, og gnaverøjet kræver innovative teknikker til effektiv håndtering8.
I den nuværende demonstrerede metode opnås det enukleerede museøjeæble med det tredje øjenlåg fastgjort til effektiv og nem håndtering. Ved hjælp af det tredje øjenlåg kan øjet immobiliseres fuldstændigt, hvilket gør det muligt for dissektionen at fortsætte me…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Alaknanda Mishra, Institut for Cellebiologi og Human Anatomi, University of California Davis, USA, trænede os i denne metode ved National Institute of Immunology, New Delhi. Dette arbejde blev støttet af kernetilskuddet modtaget fra Department of Biotechnology, Indiens regering til National Institute of Immunology, New Delhi. P.S. blev tildelt et forskningsstipendium af Institut for Bioteknologi.
Materials
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| CBA/J inbred mice | The Jackson Laboratory | Stock No. 000654 | |
| Cefotaxime (Taxim) | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma ; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet) | Reckitt Benckiser , India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma ; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD ; US | REF 303060 | |
| Isoflurane ( Forane) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
Referências
- Choi, Y., et al. Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice. Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).
- Sutherland, C., et al. Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis. J Vis Exp. (136), e57576 (2018).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).
- Claybon, A., Bishop, A. J. Dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (48), e2563 (2011).
- Steven, P., et al. Experimental induction and three-dimensional two-photon imaging of conjunctiva-associated lymphoid tissue. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (4), 1512-1517 (2008).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).
- Ullmann, J. F., Moore, B. A., Temple, S. E., Fernandez-Juricic, E., Collin, S. P. The retinal wholemount technique: A window to understanding the brain and behaviour. Brain, Behavior and Evolution. 79 (1), 26-44 (2012).
- Nakao, S., Hafezi-Moghadam, A., Ishibashi, T. Lymphatics and lymphangiogenesis in the eye. Journal of Ophthalmology. 2012, 783163 (2012).
- Mishra, A., et al. Peripheral blood-derived monocytes show neuronal properties and integration in immune-deficient rd1 mouse model upon phenotypic differentiation and induction with retinal growth factors. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 412 (2020).
