Microdissectie van het knaagdieroog
Summary
Dit artikel presenteert een protocol voor oculaire microdissectie bij knaagdieren. Het proces omvat de enucleatie van de oogbol samen met het nictitating membraan (d.w.z. het derde ooglid). Dit wordt dan gevolgd door de scheiding van de achterste en voorste oogschelpen.
Abstract
De oculaire microdissectie van het knaagdieroog omvat de segmentatie van de enucleated oogbol met het aangehechte nictitating membraan, of derde ooglid, om de voorste en achterste oogschelpen te verkrijgen. Met deze techniek kunnen de subdelen van het oog, inclusief het hoornvliesweefsel, neuraal weefsel, retinale pigmentepitheel (RPE) weefsel en lens, worden verkregen voor wholemounts, cryo-sectie en / of eencellige suspensies van een specifiek oogweefsel. De aanwezigheid van het derde ooglid biedt unieke en significante voordelen, omdat het het behoud van de oriëntatie van het oog ten goede komt, wat belangrijk is voor het begrijpen van de oogfysiologie na een gelokaliseerde interventie of in studies met oculaire analyse met betrekking tot de ruimtelijke topografie van het oog.
Bij deze methode enucleeerden we de oogbol bij de oogkas samen met het derde ooglid door voorzichtig en langzaam door de extraoculaire spieren te snijden en de oogzenuw door te snijden. De oogbol werd met behulp van een microblade door de corneale limbus gestoken. De incisie werd gebruikt als het punt van binnenkomst, waardoor langs de cornea-sclerale overgang kon worden gesneden door microscharen door het incisiepunt in te brengen. Kleine en continue sneden langs de omtrek werden gemaakt totdat de kopjes gescheiden waren. Deze kunnen verder worden ontleed door de doorschijnende laag van het neurale netvlies voorzichtig af te pellen met behulp van een Colibri-hechttang om het neurale netvlies en de RPE-lagen te verkrijgen. Verder werden drie/vier equidistante sneden gemaakt van de periferie loodrecht op het optische centrum totdat de oogzenuw werd bereikt. Hierdoor werden de halfronde kopjes in een roosvorm geopend zodat ze plat vielen en gemakkelijk gemonteerd konden worden. Deze techniek is in ons lab gebruikt voor cornea wholemounts en retinale secties. De aanwezigheid van het derde ooglid bakent de nasale-temporele oriëntatie af, wat de studie van verschillende celtherapie-interventies na transplantatie mogelijk maakt en dus de gerichte fysiologische validatie die van vitaal belang is voor visualisatie en nauwkeurige weergave in dergelijke studies.
Introduction
Oculaire dissectie is een belangrijke techniek in oogheelkundig onderzoek en heeft onderzoekers in staat gesteld om toegang te krijgen tot de segmenten van het oog voor gerichte studies. Eerder vertrouwden oculaire onderzoekers op het oogweefsel van zieke personen voor hun studies. Het geleidelijk groeiende aantal stammen van oogheelkundige knaagdiermodellen1 in de loop der jaren heeft echter de behoefte aan menselijk oogweefsel verminderd. Deze muizenstammen hebben een dieper begrip van oogziekten en interventies mogelijk gemaakt. Toch hebben ze ook een behoefte aan innovatieve technieken van oculaire microdissectie gegenereerd. De kleine omvang en het beperkte werkgebied beperken de effectieve toegang tot de oculaire subdelen ernstig. Verder is het, vanwege de homogene cellulaire assemblage van de achterste en voorste oogschelpen, moeilijk om gerichte interventies na de dissectie uit te voeren. De huidige microdissectietechnieken van laser2 en chirurgische microdissectie 3,4 zijn ontoereikend om aan dergelijke eisen van oculair onderzoek te voldoen. Laser micro-dissectie is zeer effectief in single-cell analyse, maar het specifieke weefsel moet micro-ontleed worden vóór de laserprocedure2. De techniek kan kleine interessante gebieden isoleren van een vooraf ontleed weefsel voor moleculaire analyse. De techniek is dus niet geschikt voor het voorbereiden van wholemounts of voor het isoleren van axiaal verpakte oculaire lagen voor optimale visualisatie.
De chirurgische methode is de meest gebruikte techniek; Deze methode omvat het immobiliseren van het oog via de oogzenuw5 en vervolgens het uitvoeren van de dissectie. Deze oefening is zwaar en kan elk kwetsbaar weefsel beschadigen, omdat het bolvormige oog blijft bewegen tijdens de dissectie. Ondanks dat het gunstig is voor het isoleren van de verschillende delen van de retinale lagen, kan de techniek de ruimtelijke oriëntatie van het weefsel bij dissectie niet afbakenen.
Tijdens de dissectie biedt het handhaven van de aanwezigheid van het aangehechte nictitating membraan of het derde ooglid (figuur 1) unieke en significante voordelen. Bij deze methode wordt eerst de oogbol geënucleeerd met het derde ooglid. Vervolgens wordt het derde ooglid gebruikt om het oog6 te immobiliseren (figuur 2A). Dit wordt gevolgd door het doorboren van de oogbol door de corneale limbus en het gebruik van de incisie als het punt van binnenkomst (figuur 2B, C). Vervolgens worden de oogschelpen gescheiden door anterieur en posterieur langs de omtrek te snijden (figuur 2D-G). Door de achterste oogschelp verder te ontleden, kan de doorschijnende laag van het neurale netvlies worden geïdentificeerd en voorzichtig worden afgepeld. Drie of vier equidistante sneden worden vervolgens gemaakt in de verkregen halfronde voorste en achterste kopjes, waardoor deze bloemvormige kopjes plat op een glijbaan kunnen vallen (figuur 2H).
Het derde ooglid helpt bij een eenvoudige en efficiënte hantering tijdens de dissectie, waardoor minimale schade aan het weefsel wordt gegarandeerd tijdens de toegang tot de verschillende ooglagen en bij het produceren van hele mounts. Verder helpt de aanwezigheid van het derde ooglid om gelokaliseerde interventies tijdens visualisatie te lokaliseren en te onderzoeken.
De procedure, in ons laboratorium, is uitgevoerd op een CBA / J of een rd1-muizenstam op P28 van elk geslacht. De procedure kan worden uitgevoerd op elke stam, leeftijd of geslacht van het dier en heeft geen vooroordeel volgens deze kenmerken.
De dieren werden verkregen uit commerciële bronnen (zie tabel met materialen) en onderhouden in de Small Animal Facility (SAF) van het National Institute of Immunology (NII). Ze werden gehouden in individuele geventileerde kooien (IVC) en kregen ad libitum toegang tot verzuurd geautoclaveerd water en voedsel. Ze werden gehandhaafd bij 21-23 °C en met een licht/donkercyclus van 14 uur/10 uur.
Hieronder wordt een aangepaste chirurgische methode gegeven voor de microdissectie van een muizenoog.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oculaire microdissectie is een moeilijke taak gebleken vanwege de kleine omvang en bolvorm van het knaagdieroog, en het knaagdieroog vereist innovatieve technieken voor een efficiënte hantering8.
In de huidige gedemonstreerde methode wordt de enucleated muisoogbol verkregen met het derde ooglid bevestigd voor een effectieve en eenvoudige hantering. Met behulp van het derde ooglid kan de oogbol volledig worden geïmmobiliseerd, waardoor de dissectie gemakkelijk en met …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Alaknanda Mishra, Department of Cell Biology and Human Anatomy, University of California Davis, USA, trainde ons in deze methode aan het National Institute of Immunology, New Delhi. Dit werk werd ondersteund door de kernsubsidie ontvangen van het Department of Biotechnology, Government of India aan het National Institute of Immunology, New Delhi. P.S. kreeg een onderzoeksbeurs van de afdeling Biotechnologie.
Materials
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| CBA/J inbred mice | The Jackson Laboratory | Stock No. 000654 | |
| Cefotaxime (Taxim) | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma ; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet) | Reckitt Benckiser , India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma ; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD ; US | REF 303060 | |
| Isoflurane ( Forane) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
Referências
- Choi, Y., et al. Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice. Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).
- Sutherland, C., et al. Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis. J Vis Exp. (136), e57576 (2018).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).
- Claybon, A., Bishop, A. J. Dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (48), e2563 (2011).
- Steven, P., et al. Experimental induction and three-dimensional two-photon imaging of conjunctiva-associated lymphoid tissue. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (4), 1512-1517 (2008).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).
- Ullmann, J. F., Moore, B. A., Temple, S. E., Fernandez-Juricic, E., Collin, S. P. The retinal wholemount technique: A window to understanding the brain and behaviour. Brain, Behavior and Evolution. 79 (1), 26-44 (2012).
- Nakao, S., Hafezi-Moghadam, A., Ishibashi, T. Lymphatics and lymphangiogenesis in the eye. Journal of Ophthalmology. 2012, 783163 (2012).
- Mishra, A., et al. Peripheral blood-derived monocytes show neuronal properties and integration in immune-deficient rd1 mouse model upon phenotypic differentiation and induction with retinal growth factors. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 412 (2020).
